Etiologická studie Kawasakiho choroby

Výběr pacientů a dohled nad rodinou: V National Taiwan University Hospital na Tchaj-wanu budeme studovat pacienty, kteří splňují kritéria Kawasakiho choroby nebo atypické Kawasakiho choroby, a jejich rodinné příslušníky od roku 2004 do prosince 2005. Pro tuto studii bude získán souhlas institucionální revizní komise a informovaný souhlas bude získán od všech subjektů nebo jejich rodičů. Pokud pacienti na pohotovosti, na ambulanci nebo na lůžkovém oddělení měli klinické syndromy naznačující infekci EV71, byli oni a jejich rodinní příslušníci požádáni, aby se studie zúčastnili. Výtěry z krku a konečníku pro izolaci viru a první vzorek krve. Byly zaznamenány klinické projevy, průběhy a výsledky. Pokud se u pacientů s podezřením na infekci v kterémkoli okamžiku projevily klinické příznaky, byli ostatní členové rodiny ve stejné domácnosti požádáni, aby podstoupili screening virovou izolací výtěrů z krku a dostali první vzorek krve. Dotazníkové rozhovory byly použity ke sběru informací včetně demografických údajů, počtu ložnic v domácnosti, doby kontaktu, vzorce a přítomnosti současných/nedávných příznaků a symptomů (kašel, rýma, bolest v krku, vyrážka, horečka, bolest břicha a průjem ) a předchozí kontakt s lidmi mimo domácnost, kteří měli klinické onemocnění. Následné telefonické rozhovory opakovaly otázky o známkách a symptomech v intervalech 2, 4 a 8 týdnů. Pokud některý člen rodiny uvedl, že během období sledování pociťuje známky nebo příznaky naznačující Kawasakiho chorobu, dostane tento člen domácnosti další klinické vyšetření a opakované laboratorní vyšetření na Kawasakiho chorobu. Druhý vzorek krve byl získán od případů KD a všech jejich rodinných příslušníků 4 týdny po odebrání prvního vzorku krve. Výběr kontrolního případu: Náhodně bude vybrána kontrola odpovídající věku a pohlaví. Kontrolou budou přijatí pacienti na stejném oddělení, kteří mají jiné diagnózy (např. zápal plic, UTI, angíny). Stejně jako členové domácnosti obdrží také screening na viry a bakterie.

Definice Kawasakiho choroby a atypické Kawasakiho choroby:

1. Kritéria pro Kawasakiho chorobu:

   • rovno nebo více z následujících: horečka po dobu delší než 5 dní, nehnisavá konjunktivitida, kožní vyrážka, indurace dlaně/plosky a erytém s následnou deskvamací, krční lymfadenopatie, trhlina/krvácení na jazyku nebo rtu
2. atypická Kawasakiho choroba; méně než pět z výše uvedených, ale s aneuryzmatem koronární tepny.

Laboratorní metody

1. Izolace virů a sérotypizace:

   Výtěry z krku, rektální výtěry nebo vzorky stolice byly předloženy k izolaci viru. Vzorky byly naočkovány do buněčných kultur lidských embryonálních fibroblastů, LLC-MK2, HEp-2 a rhabdomyosarkomu (RD). Když cytopatický účinek zahrnoval více než 50 % buněčné monovrstvy, buňky byly seškrábány a podrobeny nepřímému fluorescenčnímu barvení protilátek se specifickými protilátkami (Chemicon International Inc., Temecula, CA) nebo typizovány specifickými metodami podle podezřelých typů virů.

2. Molekulární diagnostika virů nebo jiných patogenů, které je obtížné kultivovat:

   1. Extrakce virové RNA a RNA: Extrakce RNA a DNA bude provedena pomocí Isolation Kit podle návodu výrobce. (sada pro extrakci RNA, Qiagen). 140 ul výtěru z krku bylo smícháno s AVL pufrem po dobu 10 až 15 minut při teplotě místnosti. Poté směs odstřeďte. Přidejte 560 ul 100% alkoholu do pelety a inkubujte po dobu alespoň 10 minut při pokojové teplotě. Směs se vloží do rotační kolony a dvakrát se centrifuguje při 8000 ot./min. po dobu 1 minuty. Poté se přidá 500 ul pufru AW1 a směs se odstřeďuje při 80 000 otáčkách za minutu po dobu 1 minuty a poté se přidá 500 ul pufru AW2 a odstřeďuje se při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 3 minut. Roztok zlikvidujte a odstřeďujte při 14000 ot./min. po dobu 2 minut. Nakonec se přidá 25 až 30 ul AVE pufru a centrifuguje se při 8000 až 10000 otáčkách za minutu po dobu 1 minuty.
   2. Reverzní transkripce: RT bude prováděna s 1. vláknem cDNA Synthesis Kit pro RT-PCR (Roche). Smíchejte dříve extrahovanou RNA s činidly včetně pufru, MgCl2, dNTP, primeru Oligo-p(dT)15, inhibitoru RNázy, reverzní transkriptázy, krátce vortexujte, inkubujte reakci při 25 °C po dobu 10 minut a poté při 42 °C po dobu 60 minut. Nakonec inkubujte při 99 °C po dobu 5 minut a poté ochlaďte na 4 °C po dobu 5 minut.
   3. TagMan PCR v reálném čase pro enterovirus, adenovirus nebo jinou virovou etiologii. Primery a sondy pro enterovirové a jiné virové PCR v reálném čase jsou v následující tabulce. Primery a sondy pro PanEV byly vybrány na základě vysoce konzervovaných oblastí v 5'-nepřekládané oblasti genomu enteroviru. Primery a sondy pro EV71 byly vybrány na základě nejrozmanitějších a nejspecifičtějších genetických oblastí v oblasti VP1 genomu enteroviru. Další potenciální viry, jako je adenovirus nebo jiné respirační viry, budou také provedeny pomocí PCR nebo RT-PCR nebo PCR v reálném čase podle pravidel výše uvedených postupů.
   4. Reprezentativní diferenciální analýza následovaná subtraktivním klonováním
3. Bakteriální kultury a detekce toxinu: Kultury byly získány z hltanu a konečníku pacientů s akutní KD před zahájením intravenózní infuze imunoglobulinu a od kontrolních pacientů pomocí systému Baxter Diagnostics Culturette, který obsahuje vatový tampon. List primárního sběru dat byl vyplněn a uložen na místě, kde byly vzorky získány. Destičky byly poté vyšetřeny na všechny â-hemolytické streptokoky skupiny A a všechny S aureus, které byly koagulázově pozitivní testem zkumavky. Tyto izoláty byly poté testovány zaslepeným způsobem na přítomnost produkce bakteriálního superantigenu imunodifúzí s antisérem proti známým stafylokokovým a streptokokovým superantigenům, jak bylo popsáno dříve. (Lee PK a Schlieveret PM).
4. Sérologický test: Sérologické testy na detekci protilátek Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO budou měřeny komerčními soupravami. Neutralizační protilátka pro enterovirus bude provedena standardním protokolem neutralizačního testu na mikrotitračních destičkách. EV71 izolát TW/2272/98 byl amplifikován a purifikován jako antigen pro m-capture ELISA pro detekci EV71 IgM. Pokud je definován potenciální patogen, bude později proveden další sérologický test na konkrétní patogen.
5. Statistická analýza: Data byla analyzována pomocí SAS Statistical Package (verze 8.2, SAS Institute, Cary, Severní Karolína). Pro spojité proměnné jsme použili Studentův t test a pro kategorická data c 2 test. Po jednorozměrné analýze screeningu statisticky významných proměnných byla provedena dopředná postupná vícenásobná logistická regresní analýza, aby se současně upravily zmatky a vypočítaly se poměry šancí upravené o více proměnných. Úroveň výběru modelu byla nastavena na 0,15 pro modely dovnitř a ven. P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné.