Untersuchen Sie die Expression von Annexin A1 und seine potenzielle Verwendung als prognostischer Marker bei Mundkrebs

MATERIAL UND METHODEN

Nach der Genehmigung durch das Hospital Review Board erhielten wir formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Proben von 115 Patienten mit primär oralem SCC und 66 Patienten mit oraler ED am Department of Pathology, National Taiwan University Hospital, Taipei, Taiwan. Die Diagnose von oralem SCC und ED basierte auf der histologischen Untersuchung von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Gewebeschnitten. Alle Patienten erhielten im Zeitraum von 1997 bis 2004 eine vollständige chirurgische Exzision der Läsionen in der Abteilung für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie oder der Abteilung für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde des National Taiwan University Hospital. Proben wurden entweder aus Inzisionsbiopsien oder vollständiger chirurgischer Exzision der Läsionen erhalten. Wenn der Lymphknoten als positiv für SCC diagnostiziert wurde, wurden Neck dissection und postoperative Strahlentherapie ebenfalls in das Behandlungsprotokoll aufgenommen. Kein Patient hatte vor den ersten Biopsien eine Krebstherapie erhalten. Einzelheiten zu den Mundgewohnheiten der Patienten, einschließlich des täglichen Konsums von AQs, Zigaretten und Alkohol, sowie die Dauer dieser Gewohnheiten, wurden ebenfalls in der Krankenakte festgehalten. Zwanzig Biopsieproben von normaler Mundschleimhaut (NOM) wurden von Nicht-AQ-Kauern und Nichtrauchern während der Extraktion betroffener bleibender unterer dritter Molaren nach Einholung der Einverständniserklärung entnommen und als gesunde Kontrollen verwendet.

Zellkultur Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA) bezogen. PD98059, Ly294002, SB203580 und Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) waren Produkte von Sigma (St. Louis, MO, USA). Anti-ANX-1-monoklonaler Antikörper wurde von BD Biosciences (Lexington, KY, USA) bezogen. Zellkultur SAS-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, Penicillin (100 UAmL)1) und Streptomycin (100 IgAmL)1) bei 37 °C unter 5 % CO2-Atmosphäre gehalten. Für die Western-Blot-Analyse wurden Zellen in 10-cm-Schalen mit 2 × 10 6 Zellen pro Schale ausgesät. Nach 18–24 h wurden die Zellen in demselben Medium, ergänzt ohne FBS, für 24 h weiter gezüchtet. Serum-ausgehungerte Zellen wurden in den angegebenen Zeiten mit HGF behandelt. Für die Immunfärbung wurden 2 x 10&sup5; Zellen, die auf Deckgläsern (22 x 22 mm) gezüchtet wurden, vor der Stimulierung mit HGF für 24 h ausgehungert.

Vorbehandlung mit PD098059, Ly294002 und SB203580 Die Zellen wurden über Nacht in Vollmedium ausplattiert und anschließend gewaschen. Die in serumfreiem DMEM kultivierten Zellen wurden mit 50 μM PD098059 (Inhibitor von ERK), 30 μM Ly294002 (Inhibitor von PI-3-Kinase) und 20 μM SB203580 (Inhibitor von p38) vorbehandelt 3 Stunden, und dann wurden sie mit 40 ng HGF für 3 Stunden behandelt. Die Zellen wurden durch Immunhistochemie und Western Blot mit ANXA1-Antikörper überprüft.

Immunzytochemie (IHC) Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Tumorproben wurden auf Annexin A1-Expression untersucht. Die IHC-Verfahren wurden als Referenz befolgt18, Der monoklonale Primärantikörper Anti-Annexin AI (1:600-Verdünnung), gerichtet gegen das N- Terminus von Annexin 1 wurden von einer Signalquelle (BD Biosciences) erhalten. Die von zwei Pathologen (Jeng und Lin) mittels Immunhistochemie bestimmte Proteintranslokation wurde als negativ (Punktzahl 0), positiv (Punktzahl 1) bewertet und die zytoplasmatische Proteinexpression wurde als negativ (Punktzahl 0), schwach (Punktzahl 1), mäßig (Punktzahl) bewertet 2) oder stark (Punktzahl 3) mit einem zuvor validierten System.

Auf Deckgläsern gezüchtete SAS-Zellen wurden mit 3,7 % Paraformaldehyd für 15 min fixiert und mit 0,2 % Triton X-100 in PBS (0,58 M Na2HPO4, 0,17 M Na H2PO4, 0,68 M NaCl, pH = 7,4) (PBST) für 5 min permeabilisiert . Nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBST wurden die Zellen für 30 min in PBS, enthaltend 1 % Rinderserumalbumin, blockiert. Die Immunfärbung wurde durch Inkubation mit monoklonalem Anti-ANX-1-Antikörper (Verdünnung 1:800) für 2 h durchgeführt. Nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBST wurden die Zellen mit TRITC-konjugiertem Kaninchen-anti-(Maus-IgG)-Ig für 1 h inkubiert. Die Deckgläser wurden mit PBST gewaschen, montiert und unter Verwendung eines Konfokalmikroskops Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Wetzlar GmbH, Deutschland) untersucht.

Zellfraktionierung SAS-Zellen wurden in 10-cm-Schalen mit 2 × 10 6 Zellen/Schale ausgesät und in DMEM für 18–24 h kultiviert. Die Zellen wurden für 24 h in serumfreiem Medium ausgehungert. Nach Behandlung mit HGF für eine gegebene Zeit wurden die Zellen geerntet und mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 100 ul Lysepuffer (10 mM Hepes, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 % NP-40, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,1 mM Dithiothreitol, 0,1 mM Natriumorthovanadat und Protease resuspendiert Inhibitoren) und 10 min auf Eis inkubiert. Die Kerne wurden durch Zentrifugation bei 2000 g für 5 min bei 4°C gesammelt. Der Überstand wurde als zytosolische Fraktion gesammelt. Die Proteinkonzentration jeder Probe wurde bestimmt.

Bewertung der Annexin A1-Proteinexpression Die Verteilungen der ANXA1-Expression in vier Kategorien (0–25 %, 26–50 %, 51–75 % und 76–100 %) mit Kerntranslokation wurden zunächst durch klinisch-pathologische Parameter der oralen ED und SCCs gezeigt und die Korrelationen zwischen mittleren Expressionsniveaus und diesen klinisch-pathologischen Parametern wurden unter Verwendung von ANOVA weiter untersucht. Die Kaplan-Meier-Produkt-Limit-Methode wurde verwendet, um die prognostische Bedeutung der ANXA1-Kernfärbung in Krebszellen sowie anderer klinisch-pathologischer Parameter zu beurteilen. Der Vergleich des kumulativen Überlebens zwischen den Gruppen wurde unter Verwendung des Log-Rank-Tests mit dem Statistica-Programm (StatSoft Inc., USA) durchgeführt. Multivariable Analysen wurden mit dem Cox-Regressionsmodell durchgeführt, um zusätzliche prognostische Werte der verschiedenen Variablen unter Verwendung von SAS 8.0 (SAS Institute Inc., USA) zu bewerten. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.