Untersuchung von durch neurodegenerative Erkrankungen induzierten Stammzellen bei Patienten und gesunden Familienkontrollen. (NeuronsiPS)

1. EINFÜHRUNG Neurologische und neurodegenerative Erkrankungen haben große Auswirkungen auf Familien und das staatliche Gesundheitswesen, da es in vielen Fällen an wirksamen und langanhaltenden Therapien mangelt. Das Fehlen dieser therapeutischen Strategien ist zum großen Teil auf die Schwierigkeit zurückzuführen, diese Pathologien in vitro zu modellieren. Tatsächlich hat die Unmöglichkeit, menschliche Neuronen in vitro zu kultivieren, die Verwendung von Tierzellmodellen erzwungen, die die Komplexität dieser menschlichen Pathologien nicht angemessen rekapitulieren. Aus diesem Grund ist es notwendig, mit der Entwicklung von In-vitro-Modellen menschlichen Ursprungs fortzufahren, die die molekularen und biochemischen Eigenschaften dieser Krankheiten reproduzieren.

   Die Entdeckung der zellulären Reprogrammierung ermöglichte die Erzeugung pluripotenter Stammzellen aus der Umwandlung somatischer Zellen, die erwachsenen Individuen entnommen wurden. Diese Technologie basiert auf der Expression der 4 Gene OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC, die synergistisch ausreichen, um somatische Zellen in induzierte Stammzellen namens iPS umzuwandeln (1,2). Für diese Technologie wurde Prof. S. Yamanaka von der Universität Kyoto 2012 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet (3). Humane iPS-induzierte Stammzellen können über einen längeren Zeitraum stabil in vitro gehalten und dann in jede spezialisierte Zelle, einschließlich Neuronen und Gliazellen, differenziert werden. Auf diese Weise ist es daher möglich, menschliche Neuronen aus erwachsenen Individuen zu generieren, die an neurologischen Pathologien leiden, was die Untersuchung pathophysiologischer Mechanismen in Zellen ermöglicht, die von diesen Krankheiten betroffen sind. Die Forschung der letzten Jahre hat viele zuverlässige Protokolle etabliert, um menschliche iPS-Zellen in verschiedene Subtypen von Neuronen (Glutamatergen, GABAergen, Dopaminergen), Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia zu differenzieren (4-6). Dank dieser Verfahren war es möglich, neuronale und gliale Modelle vieler neurologischer Erkrankungen zu generieren, indem sehr nützliche Systeme zur Untersuchung pathologischer Prozesse und zur Identifizierung neuer therapeutischer Ziele für einige genetische Formen von Alzheimer, Parkinson und Autismus geschaffen wurden (7-9).

   Die vorschlagende Gruppe verfügt bereits über große Erfahrung in der Erzeugung von iPS-Zellen durch Umprogrammierung und deren Differenzierung in Neuronen und Gliazellen, die für zelluläre Studien zu neurologischen Erkrankungen nützlich sind. Beispielsweise hat die Gruppe von Dr. Broccoli iPS-Zellen von Patienten mit Parkinson-Krankheit und Mutationen im OPA1-Gen generiert (8). Die Untersuchung von durch diese iPS-Zellen differenzierten Neuronen ermöglichte es, mitochondriale Defekte an der Basis neuronaler Dysfunktionen zu identifizieren und zum ersten Mal zu identifizieren, wie die Degeneration von dopaminergen Neuronen auch von einem beweglichen Modus des Zelltods namens Nekroptose abhängt (8).

   Die Forscher schlagen daher vor, Linien von iPS-Zellen von Patienten mit genetischen Mutationen zu etablieren, die für neurologische und neurodegenerative Erkrankungen verantwortlich sind, um neuronale und gliale Modelle in vitro für die Untersuchung pathologischer Mechanismen und die Validierung neuer zukünftiger experimenteller Therapien zu erzeugen.

2. ZWECK UND ZEICHNUNG DER STUDIE Ziel dieser Studie ist es, iPS-induzierte Stammzelllinien von Patienten mit neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen zu generieren, um sich in Neuronen und Gliazellen zu differenzieren, um die pathologischen zellulären und molekularen Prozesse dieser Erkrankungen zu untersuchen. Diese In-vitro-Kulturen werden auch zur Validierung von Molekülen oder experimentellen Therapieansätzen verwendet. IPS-Zellen werden durch Reprogrammierung isolierter 10-ml-Zellen aus peripherem venösem Blut erzeugt.

Die Studie umfasst daher die Entnahme von 10 ml peripherem Blut

1. Personen, die genetische Mutationen tragen, die die Entwicklung von neurologischen und/oder neurodegenerativen Erkrankungen bedingen.
2. Verwandte oder Familien kontrollieren Nichtträger genetischer Mutationen, die die Entwicklung von Stoffwechsel- und/oder neurodegenerativen Erkrankungen bedingen (gesunde Spender).

3. EXPERIMENTELLE PHASE

1. Nach einem neurologischen Besuch wird vom Neurologen eine neurologische Beratung angefordert.
2. Es wird eine genetische Beratung durchgeführt und der durchzuführende molekulare Test identifiziert. Klassische diagnostische Wege werden nach spezifischen nationalen Richtlinien für jede Pathologie angewendet (SIGU: http://www.sigu.net/show/attivita/5/1/LINEE%20GUIDA%20SIGU) die die Analyse am geeignetsten für die Analyse angeben und vor allem häufiger involviert sind.
3. Blutentnahme nach Unterzeichnung einer Einwilligungserklärung (Einverständniserklärung Neuromed Version 12.02.2015) für die diagnostische Untersuchung. Ungefähr 10 Milliliter Blut werden entnommen und anschließend wird ein Teil in Serum und Lymphozyten fraktioniert, die bei -80 ° C gelagert werden.
4. Molekulare Analysen werden am Zentrum für Molekulargenetik des IRCCS INM Neuromed Institute durch NGS- oder Sanger-Sequenzierung, Multiplex-Ligations-abhängige Sondenamplifikation (MLPA) und Mikrosatelliten durchgeführt.
5. Wenn die molekulare Diagnostik ein Gen und/oder eine interessierende Variante identifiziert hat, die mit dem klinischen Phänotyp kompatibel ist, oder eine Variante mit ungewisser klinischer Bedeutung (VoUS) identifiziert hat, wird die tatsächliche wissenschaftliche Bedeutung der Generierung der iPS-Stammzellen des Patienten im Objekt bewertet
6. Wenn die Möglichkeit der Generierung solcher Zellen positiv bewertet wird, wird der Patient während der Beratung gleichzeitig mit der Rücknahme des Berichts um seine Zustimmung (Einverständniserklärung Neuromed Version 12.02.2015) zur Teilnahme an diesem Forschungsprotokoll gebeten. Eine periphere Blutprobe von 10 ml wird durchgeführt.
7. Blutproben in Röhrchen mit EDTA als Antikoagulans werden per Expresskurier an das Labor von Dr. Vania Broccoli im San Raffaele Hospital (OSR) geschickt, wo die mononukleären Zellen des Blutes in iPS-Stammzellen umprogrammiert werden.
8. Ein Teil der in OSR generierten iPS-Stammzellen wird an das NEUROMED gesendet, um die pathologische Mutation und die korrekte Zellgenetik zu bestätigen
9. iPS-Stammzellen werden zur Untersuchung der pathologischen Mechanismen, die der Neuropathologie zugrunde liegen, in Neuronen und Gliazellen differenziert.
10. Aliquots von iPS-Stammzellen werden sowohl in OSR als auch in NEUROMED in flüssigem Stickstoff kryokonserviert, um die Aufrechterhaltung der Linien sicherzustellen, die bis zum Ende der Studie aufrechterhalten werden.

4. MATERIALIEN UND METHODEN Reprogrammierung peripherer mononukleärer Blutzellen Sobald 10 ml peripheres venöses Blut erhalten sind, werden mononukleäre Zellen (PBMCs) isoliert und reprogrammiert unter Verwendung des Sendai-RNA-Virus, das die 4 Gene SOX2, OCT4, KLF4 und c exprimiert -MYC ohne Integration in das Zellgenom. Diese Operation wird in sterilen BL2-Räumen durchgeführt, die im Labor von Dr. Vania Broccoli in der Abteilung für Neurowissenschaften des Krankenhauses San Raffaele in Mailand zur Verfügung stehen.

Dann werden die PBMCs dann auf einer Fibroblastenmatte in sterilen 10-mm-Petrischalen mit einem mit dem Zytokin bFGF (4 ng/ml) angereicherten Kulturmedium ausplattiert (8). Unter diesen Kulturbedingungen sind die ersten iPS-reprogrammierten Stammzellklone nach etwa 30 Tagen sichtbar. An diesem Punkt werden die einzelnen Klone isoliert und gezüchtet, um die Anzahl der Zellen zu amplifizieren und proliferierende Linien zu etablieren. Die Nachkommen der einzelnen Klone werden untersucht, um die korrekte Reprogrammierung in pluripotenten Stammzellen zu verifizieren durch: 1) Aktivierung von Markergenen des Zustands pluripotenter Staminalität (Nanog, Sox2, Oct4, SEEA4), Fähigkeit zur In-vitro-Differenzierung im Körper Zellen der drei Schichten embryonales Endoderm, Mesoderm und Ektoderm, minimale Kontamination differenzierter Zellen in der Kultur. Sobald die induzierte pluripotente Stammzellgeneration (iPS) validiert wurde, werden die Zellen zur Differenzierung in verschiedene neuronale und gliale Typen für Experimente verwendet, die darauf abzielen, die pathogenetischen Mechanismen der Studienkrankheiten des Probanden zu verstehen und zu beschreiben. Für die Erzeugung von Neuronen wird dem von Shi und Kollegen (5) entwickelten Protokoll gefolgt, das Retinsäure und TGFbeta/BMP-Protein-Inhibitoren verwendet, um die neuroektodermale Differenzierung zu lenken. Dieses Verfahren wurde bereits validiert und in unseren Labors verwendet, um die Differenzierung von iPS-Stammzellen in reife und funktionierende Neuronen zu demonstrieren (10) (Abbildung 1).

Sobald die Prozesse der Differenzierung mit iPS-Stammzellen etabliert sind, werden die Forscher mit der Analyse des Phänotyps in den Patientenzellen in Bezug auf Kontrollen fortfahren, die von gesunden Kontrollen stammen. Im Hinblick auf die Analysen in Neuronen werden insbesondere Überlebensparameter, neuronale Aktivität durch elektrophysiologische Ableitungen, mitochondriale Morphologie und Stoffwechsel, Stress des endoplasmatischen Retikulums sowie Synapsenbildung und -funktion untersucht. Für Gliazellen werden die Entzündungsgrade einschließlich der Aktivität von TNF-alpha, IL-1beta, IL-4, IL-6 und NOS-Proteinen analysiert. Parallel zu diesen Studien wird eine genomische Analyse durchgeführt, indem die Genexpressionsprofile von Neuronen und Gliazellen verglichen werden. Die Analyse wird für RNA-Seq durchgeführt, eine „Next-Generation-Sequencing“-Technik, die es ermöglicht, die Expressionsniveaus aller Gene im Genom zu analysieren. Die so identifizierten Gene werden mit Real-Time-PCR-Analysen validiert und ihre Funktion in Neuronen und Zellen, die von den Zellen des Patienten stammen, untersucht.

5. STATISTIK Für die Untersuchung pathologischer Prozesse werden 6 Linien von iPS-Zellen von jedem Patienten und gesunden Individuum abgeleitet. Die Forscher gehen aufgrund unserer bisherigen Erfahrung davon aus, dass der Vergleich zwischen dieser Anzahl von Linien zwischen Patient und gesundem Spender mehr als ausreichend ist, um statistische Signifikanz für die verschiedenen durchzuführenden In-vitro-Experimente zu haben. Für den Fall, dass es möglich sein wird, im unwahrscheinlichen Fall, dass es notwendig war, neue Linien von iPS-Zellen von demselben Patienten zu generieren.

6. ETHISCHE ASPEKTE Die in der Studie beschriebenen Verfahren zur Durchführung, Durchführung und Dokumentation sollen sicherstellen, dass die in der Deklaration von Helsinki und ihren Überarbeitungen festgelegten ethischen Grundsätze eingehalten werden. Die Studie wird unter Berücksichtigung regulatorischer Anforderungen und gesetzlicher Verpflichtungen durchgeführt. Die normative Referenz wird insbesondere durch die DL Nr. 211 vom 24.06.2003 und DM 17.12.2004 zu gemeinnützigen Studien dargestellt. Darüber hinaus erhalten alle potenziell geeigneten Patienten vor der Aufnahme vollständige und umfassende Informationen über die Studie. Um aufgenommen zu werden, müssen die Patienten der Teilnahme an der Studie und der Verarbeitung personenbezogener Daten gemäß dem Gesetz 196/03 zum Schutz von Personen und zur Verarbeitung personenbezogener Daten zustimmen. Die zuvor von der Ethikkommission genehmigte Einverständniserklärung wird verwendet.

7. ENDGÜLTIGE ZIELE Dieses Programm zielt darauf ab, die subzellulären Prozesse zu identifizieren, die genau in menschlichen Zellen (Neuronen und i) verändert sind, die von den fraglichen Neuropathologien betroffen sind. Darüber hinaus wird diese Studie es uns auch ermöglichen, molekulare Daten mit dem Ziel zu integrieren, Gene zu identifizieren, deren spezifische Veränderungen diesen zellulären Dysfunktionen zugrunde liegen könnten. Das ultimative Ziel dieses experimentellen Programms ist es, die Veränderung spezifischer molekularer Mechanismen zu identifizieren, die diesen Krankheiten zugrunde liegen. Dieses neue Wissen wird wesentlich sein, um über die Entwicklung neuer translationaler Strategien basierend auf pharmakologischen Ansätzen oder Gentherapie nachzudenken. Dies ist von großer Bedeutung, da die fraglichen Krankheiten Waisen einer wirksamen Behandlung sind und auf ausschließlich symptomatische Behandlungen beschränkt sind.

8. PROJEKTKOSTEN Molekulare Diagnostik wird routinemäßig am Molecular Genetics Center des IRCCS Neuromed durchgeführt. Es entstehen keine zusätzlichen Kosten, da die Analysen Teil diagnostischer Verfahren sind, die in Absprache mit dem NHS durchgeführt werden.

Die IPS-Generierung wird von IRCCS San Raffaele durchgeführt. Die Kosten für die Entwicklung dieser Linien sind daher vollständig von ihnen abhängig.