Methylierung der DNA bei Kindern und Jugendlichen mit Typ-1-Diabetes mellitus (METHYLDIAB) (METHYLDIAB)

Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) ist eine gut untersuchte Autoimmunerkrankung, die aufgrund des selektiven Verlusts von β-Zellen zu einem Insulinmangel führt. Umwelt- und genetische Faktoren scheinen bei genetisch anfälligen Personen ein komplexes Zusammenspiel zu haben, das zur Entwicklung von T1DM führt.

Epigenetik ist ein neues Gebiet der Biologie, das die vererbten Veränderungen in der Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Expression untersucht, die nicht auf DNA-Sequenzveränderungen durch DNA-Methylierung, Histonmodifikation und Mikro-RNAs, die als posttranskriptionelle Regulatoren fungieren, zurückgeführt werden können.

Die Methylierung von Cytosin-Guanosin-Dinukleotiden (CpGs), die sich in der Promotorregion der Gene befinden, spielt eine entscheidende Rolle bei der Transkription und Genexpression und wird an der 5'-Cytosin-Position durch Enzyme namens DNA-Methyltransferasen (DNMTs) katalysiert.

Bisher wurde eine begrenzte Anzahl von Studien zur Epigenetik bei pädiatrischen T1DM-Patienten veröffentlicht. Der Zweck der vorliegenden Studie besteht darin, das Methylierungsmuster der CpG-Inseln in den Promotorregionen spezifischer Suszeptibilitätsgene wie Protein-Tyrosinphosphatase, Nichtrezeptor Typ 22 (PTPN-22), Insulin (INS) und menschliches Leukozytenantigen G (HLA) zu untersuchen -G)-Gene, extrahiert aus weißen Blutkörperchen (WBCs) von T1DM und gesunden Kontrollkindern und Jugendlichen.

Zwanzig Patienten und zwanzig alters- und geschlechtsangepasste Kontrollpersonen wurden rekrutiert. Bei allen Studienteilnehmern wurde eine detaillierte persönliche, familiäre und schwangerschafts-/perinatale Anamnese erhoben und eine gründliche körperliche Untersuchung durchgeführt. Bei beiden Gruppen und ihren Verwandten ersten Grades gab es keine Vorgeschichte anderer Autoimmunerkrankungen.

Laut der Erklärung von Helsinki for Research gaben die Eltern eine schriftliche Einverständniserklärung für die Teilnahme ihrer Kinder ab. Einbeziehung menschlicher Subjekte.

Die Protokolle wurden vom Bioethik-Komitee der School of Medicine, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Aristoteles-Universität Thessaloniki, Thessaloniki, Griechenland, genehmigt (Protokoll Nr. 185/30.12.2015).

Nach einer 12-stündigen Fastenperiode wurden von beiden Gruppen Vollblutproben entnommen und sofort bei -80 °C gelagert.

DNA wurde aus Blutproben mit dem DNA-Extraktionskit QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN Inc, CA, USA) extrahiert, wie vom Hersteller empfohlen. Isolierte Proben wurden spektrophotometrisch unter Verwendung des Odds Ratio (OD-Verhältnis) 260/280 (1 OD = 50 μg/ml) quantifiziert (BioPhotometer 6131 Eppendorf AG, Deutschland). Die Bisulfit-Behandlung wurde an 300 ng DNA jeder Probe unter Verwendung des EZ DNA Methylation-Gold-Kits (Zymo Research, Methylation-Gold, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Durch die Behandlung mit Natriumbisulfat werden unmethylierte Cytosine in Uracile umgewandelt, während methylierte Cytosine unter den gleichen stabilen Bedingungen unverändert bleiben.

Für die Amplifikation des INS-Genpromotors wurden genspezifische Primer wie folgt verwendet: INS-Forward 5'-TATTTTGGAATTTTGAGTTTATT-3' und INS-Reverse 5'-AACAAAAATCTAAAAACAACAA-3', für PTPN-22-Forward 5'-TTTTGGTTTATGTTGTAGAGT -3΄ und PTPN-22 Reverse 5΄- ATTTTATTTTATTATTTATATGTAA-3' und für HLA-G- Forward 5'-TAGGGAGTTTAGTTTAGGGAT -3' und Reverse 5'- TTAAGGATGGTGGTTATGG -3'.

Zusätzliche Überhang-Adaptersequenzen wurden zu den ortsspezifischen Primern für die Zielregionen hinzugefügt (Nextera Transposase Adaptors, Illumina), um eine schnelle Konstruktion von NGS-Bibliotheken (Next Generation Sequencing) zu ermöglichen. Produkte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden auf einem Niedertemperatur-Rampengerät, dem Thermocycler 9700 (Eppendorf AG Nr. 5341, Emulationsmodus 9600), unter Verwendung der AmpliTaq Gold DNA-Polymerase amplifiziert.

Nach der Reinigung von PCR-Produkten mit hochreaktiven supermagnetischen Beads NucleoMag NGS Clean-up und Size Select (Macherey-Nagel. Katze. Nummer 744970.5.) wurden sie in ähnlichen molaren Mengen gepoolt und gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Bibliothekskonstruktion eingereicht, Nextera XT DNA Library Prepared Kit, Research Illumina.

Für NGS wurden Paired-End-Reads mit einer Leselängenbildung von 2 x 250 Basenpaaren auf einer MiSeq-Plattform von Illumina ausgewählt.

Sequenzanalyse-Lesevorgänge wurden unter Verwendung von FASTQ-Dateien durchgeführt und der Methylierungsstatus wurde mit dem Tool ampliMethProfiler geschätzt, einer Python-basierten Pipeline für gezielt tiefbisulfitsequenzierte Amplifikate. Der Methylierungsstatus wurde an zehn CpG-Stellen des INS-Genpromotors und vier CpG-Stellen von PTPN analysiert -22-Gen und neunzehn CpG-Stellen des HLA-G-Gens um die Transkriptionsstartstelle (TSS) herum.

Die Sequenzen und die Identifizierung der methylierten und unmethylierten Stellen werden von Bioinformatikern interpretiert.

Es wird eine Datenbank erstellt und alle Daten einer statistischen Analyse unterzogen. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen der vorliegenden Studie werden in Peer-Review-Zeitschriften veröffentlicht und auf nationalen und internationalen Tagungen präsentiert.