Mahlzeiten, Mikrobiota und psychische Gesundheit von Kindern und Jugendlichen (MMM)

Mit der aktuellen Pilotstudie soll die Machbarkeit der eingesetzten Methoden getestet werden. Wenn sich die Methodik als praktikabel erweist, werden die n=40+ Fälle und Kontrollen/Geschwister der hier beantragten Pilotstudie in die größere Studie aufgenommen. Für diejenigen Fälle, die zur Teilnahme eingeladen werden und die Teilnahme ablehnen, werden Informationen über die endgültige medizinische Diagnose des Kindes aus Zeitschriften gesammelt, aber keine anderen Informationen. In der aktuellen Pilotstudie (Informationen aus den ersten 20 Fällen, Kontrollen und Geschwistern) werden die Teilnehmer gefragt, ob sie bereit sind, Gründe für eine Nichtteilnahme anzugeben (wobei gleichzeitig versichert wird, dass sie dies auf keinen Fall tun müssen).

Fragebögen zu Ernährung, psychischer Gesundheit und Hintergrunddaten werden webbasiert mit Hilfe des Forschungsdatenmanagementunternehmens Smart Trial (https://www.smart-trial.co) Umwandlung in ein lesbares elektronisches Format. Dieses Verfahren wurde gründlich qualitätsgeprüft und sichert die ordnungsgemäße Speicherung der Daten. Testen der Ernährungsprogramme für Nährstoffberechnungen aus Nahrungs- und Nahrungsergänzungsmittelaufnahmedaten, basierend auf der isländischen Nahrungszusammensetzungsdatenbank (ISGEM)1,2 sowie Software für die Analyse von Fragebögen zur psychischen Gesundheit.

Während sie auf der Warteliste stehen, um in die Ambulanz zu kommen, erhalten die Erziehungsberechtigten und das Kind Einladungsschreiben. Bei Interesse an einer Teilnahme folgt nach einem telefonischen Nachgespräch ein Hausbesuch durch den Projektbeauftragten der UNR, bei dem die Einverständniserklärung unterzeichnet wird. In dieser Phase werden auch Kontaktinformationen zum Lehrer des Kindes empfangen. Ein Kit mit Werkzeugen zum Sammeln biologischer Proben mit guter Anleitung sowie ein Heft für die dreitägige Ernährungsaufzeichnung werden zur Verfügung gestellt. Die Fragebögen, die zusätzliche Informationen sammeln, wie die kurze validierte Häufigkeit der Nahrungs- und Nahrungsergänzungsmittelaufnahme, der ICEFFQII, der für das isländische Lebensmittelumfeld3,4 entwickelt wurde, Nahrungsmittelaversionen, körperliche Beschwerden oder Diagnosen ROMEIV5-7, atopische Erkrankungen iFAAM8 und Medikamente sowie andere wichtige Hintergrundfaktoren werden online ausgefüllt, wobei jeder Teilnehmer Codes zum Freischalten der Fragebögen erhält. Die in dieser Studie verwendeten Fragebögen zur psychischen Gesundheit wurden alle international sowie in Island validiert. Diese sind; 1) Lehrer- und Elternberichte: Die ADHS-Bewertungsskalen9-11, die Child Behaviour Checklist (TRF und CBCL), eine Familie von Symptom-Checklisten, die entwickelt wurden, um Informationen zu einem breiten Spektrum von emotionalen und Verhaltensproblemen bereitzustellen.12-15; der High-Functioning Autism Spectrum Screening Questionnaire (ASSQ)16 und die Social Responsiveness Scale (SRS)17-21. 2) Selbstberichte für Kinder >10 Jahre: The Children's Depression Inventory (CDI)22-26 und die Multi-Dimensional Anxiety Scale for Children (MASC)27,28-33. Darüber hinaus werden, sofern von den Erziehungsberechtigten erlaubt, Informationen über verschreibungspflichtige Medikamente, die für das Kind von der Geburt bis zum aktuellen Datum ausgegeben wurden, aus dem isländischen Arzneimittelregister (IMR) abgerufen. Weitere Informationen zu den verwendeten Fragebögen finden sich in Anhang 1.

Nach der Sammlung von Daten aus dem Fall wird ein zufällig ausgewähltes Kind, das nach Geschlecht und Alter abgeglichen wird, vom Social Sciences Research Institute (SSRI) an der Universität von Island im selben Postbereich gefunden und zur Teilnahme eingeladen, indem es eine Einführung sendet Brief, gefolgt von einem Anruf. Das SSRI findet 5 Kontrollen für jeden Fall, der die Studie abgeschlossen hat, da die Teilnahmerate möglicherweise niedrig ist. Diese werden in der vom SSRI bereitgestellten Reihenfolge aufgerufen.

Die biologischen Proben sind vorzugsweise gegen Ende der 3-tägigen Lebensmittelregistrierung mit Hilfe von Erziehungsberechtigten nach Standardverfahren mit speziellen Geräten einschließlich Stabilisierungsfaktoren zu sammeln und kalt (4-8 ° C) zu lagern. Das Kit wird dann von den Forschern aus beiden Fällen und Kontrollen zusammen mit dem Ernährungstagebuch in der Nähe von Reykjavik, Akureyri und Umgebung gesammelt. Die Teilnehmer können die Proben auch entweder an das BUGL oder die Ernährungsabteilung, beide am Universitätsspital Landspitali, liefern. Für andere Standorte werden die Proben zusammen mit Richtlinien für den Rückversand an die Forscher nach ihrer Entnahme versandt. Die Urinproben werden in kleinere Röhrchen aufgeteilt, um sie zusammen mit den anderen biologischen Proben in einer Laboreinheit des Universitätskrankenhauses oder des Akureyri-Krankenhauses in einem -80 °C-Gefrierschrank aufzubewahren. Im Laufe des Jahres der Rekrutierung wird die Diagnose aller Patienten, die zu BUGL kommen, aufgezeichnet, um potenzielle Auswahlverzerrungen bei der Datenerfassung erkennen zu können.

Die Arbeit an der Dateneingabe wird durch die webbasierten Fragebögen, bei denen Informationen direkt in Datenblätter eingegeben werden, auf ein Minimum beschränkt. Informationen zur aktuellen Ernährung werden für Mahlzeitenhäufigkeit, Nahrungshäufigkeit und Nahrungsaufnahme sowie Energie-, Makro- und Mikronährstoffaufnahme aus Nahrung und Nahrungsergänzungsmitteln unter Verwendung des dreitägigen Ernährungstagebuchs und eines Fragebogens zur Häufigkeit der Nahrungsaufnahme (ICEFFQII)3 und Informationen dazu berechnet Essensabneigungen. Körperliche Beschwerden werden anhand des diagnostischen Fragebogens zu pädiatrischen funktionellen Magen-Darm-Störungen bei Kindern und Jugendlichen (ROMEIV)34 und eines Fragebogens zu atopischen Reaktionen bei Kindern (iFAAM)8 erhoben. Zusätzlich werden Informationen aus den Fragebögen der Eltern zu Schwangerschafts- und Geburtsgeschichte, Stillzeit, Nahrungsmittelunverträglichkeit, Defäkationshäufigkeit, Traumata im Laufe des Lebens, sozioökonomische Faktoren, körperliche Aktivität, Schlafgewohnheiten und anthropometrische Daten erhoben. Während des gesamten Zeitraums werden Qualitätsprüfungen sowie einfache deskriptive statistische Analysen durchgeführt.

Einige der Fragebögen zur psychischen Gesundheit benötigen spezielle Software, um ausgeführt zu werden, die für diese Studie gekauft wird. Darüber hinaus wird der Aufwand für die Eingabe von Daten durch die webbasierten Fragebögen, bei denen Informationen direkt in Datenblätter eingegeben werden, auf ein Minimum beschränkt. Der psychische Gesundheitszustand der Fälle basiert auf den besten klinischen Diagnosen von Experten, die in der Regel über einen langen Zeitraum gesammelt wurden, oft mit halbstrukturierten klinischen Interviews. Diese Längsschnittdaten enthalten sowohl dimensionale als auch kategoriale Daten (mit Diagnosen) mit umfassenden und aussagekräftigen klinischen Informationen (Patient, Eltern, Schule etc.). Informationen zur Medikation des Kindes von Geburt an werden aus dem isländischen Arzneimittelregister (IMR) abgerufen.

Alle Proben werden am Ende des Studienzeitraums zum gleichen Zeitpunkt gemessen und zur Analyse an die jeweiligen Standorte geschickt. Die Proben werden im Hinblick auf den Fallkontrollstatus randomisiert, bevor Messungen durchgeführt werden. Folgendes wird gemessen:

1. Stuhlproben, Speichel und Wangenabstrich: Mikrobiom-Shotgun-Analysen werden gemäß zuvor veröffentlichten Protokollen durchgeführt, die auf 16S rDNA71-73 abzielen, und Genotypisierung wird an menschlicher DNA durchgeführt, die aus Wangenabstrichproben mit PCR-basierten Methoden isoliert wurde. Hochwertige DNA aus Abstrich- und Stuhlproben wird mit dem im Handel erhältlichen QIAamp PowerFecal DNA-Extraktionskit extrahiert. Auf die DNA-Isolierung folgt eine PCR-Amplifikation unter Verwendung universeller prokaryotischer Primer. Die Sequenzierung wird unter Verwendung einer Hochdurchsatzplattform von Illumina und einer Pair-End-Modalität unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt. Die resultierenden Sequenzen werden mit der End-to-End-Mikrobiomanalysepipeline QIIME 2 zur Sequenzqualitätskontrolle, Chimärenentfernung, Zuordnung von Sequenzen zu Proben und Definition von Sequenzvarianten (SVs) analysiert. SVs werden unter Verwendung von 16S-rRNA-Referenzdatenbanken und phylogenetischen Diversitätsmetriken der Taxonomie zugeordnet. Interaktive Visualisierung und Statistiken werden mit QIIME 2 berechnet, um Mikrobiomzusammensetzungen zu interpretieren und zu vergleichen. Die aus den Darmproben gesammelten Datensätze zur mikrobiellen Diversität werden für den Aufbau einer Mikrobiota-Datenbank verwendet. Die Genotypisierung wird an menschlicher DNA durchgeführt, die aus bukkalen Austauschproben unter Verwendung von PCR-basierten Methoden isoliert wurde.
2. Urinprobe: Eine Morgenurinprobe wird zu Hause in einem Röhrchen mit Peptidinhibitoren gesammelt. Der Urin wird in zwei Proben geteilt, eine für die Analyse der gezielten Analyse von mit Nahrungsmitteln in Verbindung stehenden Peptiden auf einer HPLC-Umkehrphasen(C-18)-Chromatographie, die die Gesamtpeptidmenge im Verhältnis zu Kreatinin ergibt. Die andere Urinprobe wird für ein ungezieltes Metabolomik-Profiling (LC-ESI-qTOF-MS) verwendet.
3. Blutproben: Entzündliche Biomarker werden durch Multiplex-Immunoassays auf Basis der Mesoscale-Discovery-Plattform (z. CRP, Interleukine) und Ernährungszustand (Hämoglobin, Ferritin, Folsäure, Vitamin B12, 25-Hydroxy-Vitamin-D, ⍵-3-Fettsäuren durch Kits im Landspitali-Labor. Messungen von Zonulin aus Serum werden durch Assays basierend auf der Methode des kompetitiven ELISA durchgeführt.35

Für jede Art von Omics- und Biomarker-Daten (Mikrobiota, Metabolomics, lebensmittelbezogene Peptide, Entzündungsfaktoren, Nährstoffe) wird eine angemessene Vorverarbeitung und Qualitätskontrolle koordiniert und von den oben angegebenen Datenerstellungsgruppen durchgeführt. Alle Daten werden entsprechend normalisiert und transformiert, auf mögliche Batch-Effekte geprüft und Ausreißer entfernt. Untersucht werden die Auswirkungen möglicher Confounder wie Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, Bristol-Stuhlwaage (für Darmmikrobiom), Medikamente oder Ernährung. Für jeden Datentyp werden wir den Fall und zwei Kontrollgruppen vergleichen, aber auch Zusammenhänge zwischen den verschiedenen Variablen separat sowie in Bezug auf Untergruppen betrachten, indem wir multivariate Modelle einschließlich Anpassungen für Confounder-Variablen verwenden. Die Benjamini-Hochberg-Falschentdeckungsrate wird verwendet, um das Testen mehrerer Hypothesen zu korrigieren.

Für orale und intestinale Mikrobiomdaten führen wir eine Hauptkoordinatenanalyse durch, um die Zusammensetzungsunterschiede zwischen Proben zu untersuchen. Die Fall- und Kontrollgruppe werden hinsichtlich mikrobieller Diversität (Alpha- und Beta-Diversität) und taxonomischer Häufigkeit verglichen. Hier werden wir Methoden anwenden, die für Mikrobiomdaten entwickelt wurden, um die Spärlichkeit und Unterabtastung der mikrobiellen Gemeinschaft zu berücksichtigen, wie sie im R-Paket implementiert sind.36 Korrelationen zwischen mikrobiellen Arten werden mit sparCC37 kartiert, das für Zusammensetzungsdaten wie die relative Häufigkeit von Mikroben entwickelt wurde, und zwischen Fall- und Kontrollgruppen verglichen, um potenzielle Unterschiede in der Struktur der Mikrobiomgemeinschaft aufzudecken. Für die Ernährungsdaten werden die FFQs durch PCA analysiert, wobei Ernährungsmuster in den Gruppen identifiziert werden, während die dreitägige Registrierung verwendet wird, um eine genauere Aufnahme von Nahrungsmitteln zu berechnen, die in Nährstoffe (Energie, Makronährstoffe (Eiweiß, Fett, Kohlenhydrate) umgerechnet wird /Ballaststoffe)) und Mikronährstoffe (Vitamine, Mineralien und andere wichtige Faktoren). Darüber hinaus werden die Ernährungsdaten sowie Informationen zum Ernährungszustand, Entzündungsfaktoren und Omics-Daten verwendet, um Assoziationen mit oraler und fäkaler Mikrobiota zu untersuchen. Dieselbe Analyse wird auch in den größeren Untergruppen durchgeführt, beispielsweise bei Kindern mit ADHS oder Autismus. Genotypdaten von Studienteilnehmern werden verwendet, um zu untersuchen, wie Wirtsgenanker bestimmte Mikrobiota vorhersagen oder mit ihnen interagieren könnten. Hier konzentrieren wir uns auf genetische Varianten, die zuvor mit der Zusammensetzung der Mikrobiota oder psychiatrischen Störungen in Verbindung gebracht wurden.

Die Integration verschiedener Arten von hochdimensionalen Omics-Daten ist eine herausfordernde Aufgabe, und es können mehrere Ansätze verfolgt werden. Ein Berechnungsrahmen für eine solche Analyse38 wurde aufgedeckt39, basierend auf einer Dimensionsreduktion der Omics-Daten unter Verwendung von Co-Häufigkeits-Clustering, gefolgt von einer Cross-Omics-Korrelationsanalyse, die sich auf Merkmale konzentriert, die sich zwischen den Fällen und Kontrollen unterscheiden. Darüber hinaus werden wir andere Arten von Omics-Integrationsansätzen anwenden, wie kürzlich überprüft40,41, wie z. B. robuste spärliche kanonische Korrelation, Co-Trägheit oder Procrustes-Analyse, um gemeinsame Muster über Omics- und Ernährungsdaten im Kontext der psychischen Gesundheit zu identifizieren.