Análisis cuantitativo del gen SMN1 y SMN2 basado en el sistema DHPLC

La atrofia muscular espinal proximal es un trastorno autosómico recesivo con una incidencia global de 1 en 10000 nacidos vivos y una frecuencia de portadores de 1 en 50. Esta grave enfermedad neuromuscular se caracteriza por una degeneración y pérdida de las neuronas motoras alfa de las células del asta anterior de la médula espinal, lo que provoca debilidad simétrica progresiva, atrofia de los músculos voluntarios proximales y muerte infantil.

Se han identificado las dos copias más idénticas del gen SMN, SMN telomérico (SMN1) y SMN centromérico (SMN2). Estos dos genes SMN son altamente homólogos y difieren en solo cinco intercambios de nucleótidos dentro de sus regiones 3'. Estas variaciones no alteran los aminoácidos codificados. Estas diferencias de nucleótidos ubicadas en los exones 7 y 8 permiten distinguir el gen SMN1 del gen SMN2.

Se ha informado que más del 95% de los pacientes con AME tenían deleción homocigótica del gen SMN1. Por tanto, la detección de la ausencia de SMN1 puede ser una herramienta útil para el diagnóstico de AME. Además, debido a la alta incidencia de AME, la alta frecuencia de portadores de al menos 1 en 50, la gravedad de la enfermedad en los pacientes y la falta de eficacia del tratamiento, la prueba de portadores para la eliminación de SMN1 es una cuestión importante en el asesoramiento genético. . Sin embargo, también existe un gen SMN2 altamente homólogo que dificulta la detección de la pérdida de SMN1, lo que dificulta la detección de la prueba de portador de SMA.

Aquí, presentamos un método nuevo, rápido, simple y altamente confiable para detectar la eliminación de SMN1 y determinar el número de copias de SMN1 y SMN2 desnaturalizando la cromatografía líquida de alto rendimiento (DHPLC). DHPLC es un método novedoso, simple, rápido y sin gel que es muy sensible y específico para la detección de variaciones de ADN. Además, describimos una estrategia de PCR multiplex para determinar el número de copias de los genes SMN1 y SMN2 para evitar el sesgo debido a las fluctuaciones en el número de copias de los genes SMN. El ensayo utiliza el gen CYBB ligado al cromosoma X y el gen KRIT1 como estándares para determinar la dosis relativa de genes SMN1 y SMN2. Demostramos que este ensayo puede distinguir con precisión 2 copias de genes de 4 copias de genes y puede identificar portadores de AME y poblaciones normales mediante la determinación precisa del número de copias de SMN.

Este proyecto contribuirá a aplicar esta herramienta novedosa, rápida y confiable para el diagnóstico de AME y la detección de portadores de los genes SMN1 y SMN2 mediante el uso del sistema DHPLC.