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La expresión de IL-15 y su receptor en decidua

20 de diciembre de 2005 actualizado por: National Taiwan University Hospital

La expresión de IL-15 y su receptor en células NK uterinas y aplicaciones clínicas

El tejido decidual humano parece desempeñar un papel importante no solo en la nutrición de los embriones implantados, sino también en la prevención de su rechazo por parte del sistema inmunitario materno. La comprensión de las modulaciones inmunológicas maternas durante la implantación es nuestro principal interés de investigación. Nuestros estudios anteriores han demostrado que la mayoría de los linfocitos en la decidua son células asesinas naturales. Sin embargo, su fenotipo es CD16-CD56+CD3-, que es diferente al de las células asesinas naturales periféricas. Lo que es más importante, su actividad citotóxica disminuye y no pueden atacar a los citotrofoblastos. Todo esto contribuye a que no se desarrolle rechazo en la interfaz feto-materna y está relacionado con el éxito del embarazo.

En 1994 se descubrió por primera vez una nueva citocina IL-15 que podía actuar sobre los receptores de IL-15 e IL-2 para estimular la activación y propagación de los linfocitos. Queremos estudiar el papel crítico de la IL-15 en los linfocitos endometriales. En este estudio tratamos de analizar la distribución de la IL-15 y su receptor en la decidua. Aclararemos si el receptor de IL-15 existe en las células asesinas naturales deciduales y está regulado por hormonas sexuales o no y si su actividad citotóxica cambiará después de la acción de IL-15. Además, demostraremos si el receptor de IL-15 existe en las células del embrión y si la IL-15 podría mejorar la calidad del embrión. También diseñamos un sistema de cocultivo del embrión y células endometriales autólogas para mejorar la tasa de éxito de la fertilización in vitro.

Descripción general del estudio

Estado

Desconocido

Condiciones

Descripción detallada

La expresión de IL-15 e IL-15Rα en los linfocitos de sangre periférica y decidua durante el embarazo temprano

  1. Recolección de especímenes Recolectar sangre periférica y tejido decidual de 20 a 30 mujeres embarazadas de 6 a 8 semanas de edad gestacional durante el procedimiento D&C debido a la multiparidad.
  2. Tinción inmunohistoquímica de tejido decidual La sección congelada de tejido decidual se realizó de acuerdo con los procedimientos recomendados. Se añadieron secuencialmente el primer anticuerpo, el anticuerpo monoclonal IL-15 o IL-15Rα antihumano de ratón, el segundo anticuerpo, el anticuerpo policlonal antiratón de cabra marcado con peroxidasa y los reactivos de color. Finalmente, los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina.
  3. Separación de células mononucleares Se tomaron muestras de tejido decidual y sangre periférica de cada mujer embarazada en el momento del aborto. Para minimizar la contaminación por sangre, el tejido decidual se separó macroscópicamente de las vellosidades coriónicas, se lavó dos veces con solución salina balanceada de Hank, se cortó en pedazos pequeños, se lavó dos veces nuevamente y se pasó a través de una malla de 1,9 mm para eliminar la sangre residual sin tratamiento enzimático. Luego, estas muestras se filtraron a través de una malla de acero inoxidable de 45,7 μm para eliminar los restos de tejido. La solución filtrada se colocó en capas sobre un gradiente de Ficoll-Paque PLUS y se centrifugó durante 45 minutos a 400 g. Se recogió una suspensión celular enriquecida de células mononucleares en la interfase y luego se lavó dos veces con medio RPMI-1640. Las células mononucleares de sangre periférica también se aislaron mediante sedimentación con Ficoll-Paque PLUS.
  4. Análisis citométricos La expresión de IL-15 intracelular e IL-15Rα de superficie en células mononucleares se analizó con citometría de flujo. Las combinaciones de anticuerpos incluyeron: FITC/PE/PerCP- CD4/IL-15/CD3, CD8/IL-15/CD3, CD56/IL-15/CD3, CD4/IL-15Rα/CD3, CD8/IL-15Rα/CD3 , CD56/IL-15Rα/CD3.
  5. Separación de células CD4+, células CD8+ y células NK Las células CD4+, células CD8+ y células NK en sangre periférica y decidua se separaron respectivamente con clasificador de células activadas magnéticamente (MACS).
  6. PCR en tiempo real de ARNm de IL-15 e IL-15Rα El ARN total en células CD4+, células CD8+ y células NK se extrajo con Trizol y se transformó en ADNc con transcripción inversa. La PCR en tiempo real se realizó utilizando diferentes sondas para ß-actina, IL-15 e IL-15Rα con ABI PRISM 7700 Sequence Detector System. Las secuencias de los cebadores fueron: ß-actina, 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA; 5' CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC; IL-15, 5' GGC TTT GAG TAA TGA GAA TTT CGA; 5' ATC AAT TGC AAT CAA GAA GTG TTG; IL-15Rα, 5' GGC GAC GCG GGG CAT CAC; 5' TCG CTG TGG CCC TGT GGA TA.
  7. Pruebas funcionales de células CD4+, células CD8+ y células NK

    1. Ensayo proliferativo Utilizando la incorporación de BrdU durante la proliferación celular, se evaluó la capacidad proliferativa de las células CD4+, las células CD8+ y las células NK cuando se añadieron diferentes concentraciones de IL-15 e IL-2.
    2. Ensayo de secreción Las concentraciones de IFN-γ, IL-6 e IL-10 en el sobrenadante se detectaron utilizando kits ELISA cuando se añadieron diferentes concentraciones de IL-15 e IL-2 al medio de cultivo.
    3. Citotoxicidad celular basada en fluorescencia: ensayo FCC La citolisis de células diana mediada por NK y CTL constituye una forma de apoptosis y se acompaña de muchos de los mismos eventos, incluida la activación de caspasa. Incorporamos el sustrato fluorogénico para la caspasa 6 en las células diana (células K562 y citotrofoblastos autólogos) y medimos la activación de la caspasa detectando la fluorescencia emitida por el sustrato escindido.

La expresión de IL-15 e IL-15Rα en el embrión humano antes y después del cultivo conjunto con endometrio autólogo

  1. Tinción inmunocitoquímica de embrión humano Se fijaron embriones humanos del programa de FIV en el portaobjetos de adhesión con solución amortiguadora de fijación helada. Se añadieron el anticuerpo monoclonal anti-IL-15 conjugado con ficoeritrina o el anticuerpo anti-IL-15Rα humano biotinilado y el conjugado de isotiocianato de fluoresceína-estreptavidina (SAv-FITC). El fluoroscopio se usó para detectar la fluorescencia emitida por los objetivos.
  2. PCR unicelular de ARNm de IL-15 e IL-15Rα Usando el principio de "captura" de biotina/estreptavidina, el ARNm del embrión se aisló con el Micro RNA Isolation Kit, se marcó con oligo dT-sonda marcado con biotina y se extrajo con una sonda recubierta de estreptavidina. tubos Después de la transformación a cDNA, se realizó una PCR en tiempo real usando diferentes sondas para ß-actina, IL-15 e IL-15Rα con ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, como se describió anteriormente.
  3. Separación de células endometriales autólogas Se realizó una biopsia endometrial en fase lútea en un ciclo antes del procedimiento de FIV de la paciente con una cureta de succión endometrial Pipelle. El tejido se digirió con colagenasa tipo 2 al 0,2% y se dejó sedimentar por sedimentación diferencial a la unidad de gravedad. Los pasos anteriores se repitieron cuatro veces y se recogió el sobrenadante. Después de la sedimentación diferencial a la unidad de gravedad, el sobrenadante, que contenía la fracción enriquecida con estroma, se transfirió a frascos de cultivo de tejidos para uso futuro. Los trozos de tejido que quedaron después de las cuatro digestiones se resuspendieron en 10 ml de HBSS. Después de aproximadamente 30 segundos, los 8 ml superiores se dejaron sedimentar a gravedad unitaria. Esta sedimentación, que contenía una fracción enriquecida con glándulas, se resuspendió en RPMI y se sembró en frascos de cultivo de tejidos para un futuro cocultivo.
  4. Cocultivo endometrial autólogo de embrión humano Se mezcló aproximadamente una cantidad igual de células glandulares y estromales el día estimado antes de la administración de hCG durante el ciclo de FIV de la paciente. Aproximadamente 3x10 ^ 5 células se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de cuatro pocillos y los cigotos se colocaron en el sistema de cocultivo o medio convencional (líquido tubárico humano más suero materno al 15%). Las tasas de escisión y la apariencia morfológica se evaluaron diariamente. Los mejores embriones desde el punto de vista morfológico se transfirieron de nuevo a la paciente 72 horas después de la recuperación, independientemente del sistema de cultivo. La tasa de implantación se definió como el número de sacos intrauterinos con actividad cardiaca fetal por número de embriones transferidos. Los embarazos clínicos incluyeron solo aquellos embarazos con un latido cardíaco fetal documentado en una ecografía transvaginal en el día 49.
  5. La distribución de citocinas en medio de cocultivo Las citocinas, incluidas las citocinas Th1 (IL-2 e IFN-γ), las citocinas Th2 (IL-4, IL-6 e IL-10) y la IL-15 se determinaron mediante la técnica ELISA en el medio de cocultivo antes y después de sembrar embriones.
  6. Tinción inmunocitoquímica de células estromales y glandulares endometriales humanas Las células estromales y glandulares endometriales purificadas se lavaron dos veces con tampón de lavado frío para eliminar las citocinas adheridas a las células. A continuación, estas células se fijaron en el portaobjetos de adhesión con solución amortiguadora de fijación helada. Se añadieron el anticuerpo monoclonal anti-IL-15 conjugado con ficoeritrina o el anticuerpo anti-IL-15Rα humano biotinilado y el conjugado de estreptavidina-isotiocianato de fluoresceína (SAv-FITC). El fluoroscopio se usó para detectar la fluorescencia emitida por los objetivos.
  7. PCR en tiempo real de ARNm de IL-15 e IL-15Rα de células estromales y glandulares endometriales humanas El ARN total en células estromales y glandulares endometriales se extrajo con Trizol y se transformó en ADNc con transcripción inversa. La PCR en tiempo real se realizó utilizando diferentes sondas para ß-actina, IL-15 e IL-15Rα con ABI PRISM 7700 Sequence Detector System, como se describe anteriormente.

Tipo de estudio

Intervencionista

Inscripción

30

Fase

  • No aplica

Contactos y Ubicaciones

Esta sección proporciona los datos de contacto de quienes realizan el estudio e información sobre dónde se lleva a cabo este estudio.

Estudio Contacto

  • Nombre: Kuang-Han Chao, M.D.
  • Número de teléfono: 5539 886-2-2312-3456
  • Correo electrónico: khchao@ntumc.org

Ubicaciones de estudio

      • Taipei, Taiwán, 100
        • Reclutamiento
        • National Taiwan University Hospital
        • Contacto:
          • Kuang-Han Chao, M.D.
          • Número de teléfono: 5539 886-2-2312-3456
          • Correo electrónico: khchao@ntumc.org
        • Investigador principal:
          • Kuang-Han Chao, M.D.

Criterios de participación

Los investigadores buscan personas que se ajusten a una determinada descripción, denominada criterio de elegibilidad. Algunos ejemplos de estos criterios son el estado de salud general de una persona o tratamientos previos.

Criterio de elegibilidad

Edades elegibles para estudiar

20 años a 40 años (Adulto)

Acepta Voluntarios Saludables

Géneros elegibles para el estudio

Femenino

Descripción

Criterios de inclusión:

  • Edades entre 20 y 40 años
  • Consentimiento informado por escrito
  • Ciclos regulares, entre 21 y 35 días, dentro de los últimos 6 meses antes del embarazo
  • Embarazo temprano entre 4 a 10 semanas de gestación

Criterio de exclusión:

  • Sangrado vaginal anormal
  • Tratamiento concomitante con otros medicamentos
  • Enfermedades autoinmunes
  • Inflamación pélvica en los últimos 3 meses
  • Tener cualquier malignidad asociada
  • No puede o no quiere cumplir completamente con el protocolo

Plan de estudios

Esta sección proporciona detalles del plan de estudio, incluido cómo está diseñado el estudio y qué mide el estudio.

¿Cómo está diseñado el estudio?

Detalles de diseño

  • Propósito principal: Tratamiento
  • Asignación: Aleatorizado
  • Modelo Intervencionista: Asignación paralela
  • Enmascaramiento: Único

¿Qué mide el estudio?

Medidas de resultado primarias

Medida de resultado
Tasa de embarazo
Tasa de fecundación de ovocitos
Tasa de implantación de embriones

Colaboradores e Investigadores

Aquí es donde encontrará personas y organizaciones involucradas en este estudio.

Investigadores

  • Investigador principal: Kuang-Han Chao, M.D., Department of Obstetrics and Gynecology, National Taiwan University Hospital

Fechas de registro del estudio

Estas fechas rastrean el progreso del registro del estudio y los envíos de resultados resumidos a ClinicalTrials.gov. Los registros del estudio y los resultados informados son revisados ​​por la Biblioteca Nacional de Medicina (NLM) para asegurarse de que cumplan con los estándares de control de calidad específicos antes de publicarlos en el sitio web público.

Fechas importantes del estudio

Inicio del estudio

1 de septiembre de 2005

Fechas de registro del estudio

Enviado por primera vez

13 de septiembre de 2005

Primero enviado que cumplió con los criterios de control de calidad

13 de septiembre de 2005

Publicado por primera vez (Estimar)

15 de septiembre de 2005

Actualizaciones de registros de estudio

Última actualización publicada (Estimar)

21 de diciembre de 2005

Última actualización enviada que cumplió con los criterios de control de calidad

20 de diciembre de 2005

Última verificación

1 de junio de 2005

Más información

Términos relacionados con este estudio

Términos MeSH relevantes adicionales

Otros números de identificación del estudio

  • 9361701276

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