Derivación de nuevas líneas de células madre embrionarias humanas Líneas para uso clínico

Las líneas de células madre embrionarias (ES) se derivan de las células pluripotentes del embrión temprano. Las propiedades clave de las células ES son su capacidad para proliferar indefinidamente in vitro sin diferenciación y su capacidad para dar lugar a todas las células del cuerpo. La reciente derivación de líneas celulares ES de embriones humanos (Thomson et al., 1998, Reubinoff et al., 2000) atrae una atención significativa debido al notable potencial de estas células para la investigación científica básica, el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa.

Dado que las células madre embrionarias humanas (hESC, por sus siglas en inglés) son capaces de una autorrenovación ilimitada y pueden dar lugar a cualquier célula especializada a través de la diferenciación, pueden usarse potencialmente como una fuente donante ilimitada de células para trasplante en una variedad de trastornos que resultan de la pérdida de células o disfunción celular. Entre estas condiciones se encuentra la enfermedad de Parkinson, la esclerosis múltiple, la lesión medular traumática, la diabetes, la insuficiencia cardiaca, la insuficiencia hepática, etc.

Se ha propuesto que las características esenciales de las células ES de primates deberían incluir (i) la derivación del embrión preimplantacional o periimplantacional, (ii) la proliferación indiferenciada prolongada y (iii) el potencial de desarrollo estable para formar derivados de las tres capas germinales embrionarias incluso después cultivo prolongado (Thomson, 1996). Los investigadores han obtenido líneas de células madre de embriones humanos tempranos que cumplen estos criterios (Reubinoff et al., 2000). Nuestro grupo fue el segundo en el mundo en derivar líneas hESC y el primero en mostrar su potencial para sufrir diferenciación somática in vitro (Reubinoff et al., 2000).

Para explotar el notable potencial de las hESC, se requiere mejorar los métodos utilizados actualmente para cultivar y manipular las células, así como para controlar su diferenciación. En este contexto, los investigadores han desarrollado enfoques novedosos para criopreservar (Reubinoff et al., 2001), modificar genéticamente (Gropp et al., 2003; Ben-Dor et al., 2006) y controlar la diferenciación de células hESC ( Reubinoff et al., 2001, Itsykson et al., 2005).

Las líneas de células ES humanas se derivan de embriones producidos por fertilización in vitro (FIV) con fines clínicos. Los embriones congelados sobrantes que ya no son necesarios para el tratamiento de la infertilidad se reclutan para este fin después de obtener el consentimiento informado del donante y las aprobaciones de la junta de revisión institucional/nacional. Los embriones se descongelan y se cultivan hasta la etapa de blastocisto (5-6 días), se aísla la masa celular interna (ICM) compuesta por células pluripotentes y las células madre se cultivan más comúnmente en la capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón. La capa alimentadora es necesaria para evitar la diferenciación y promover la proliferación de las células madre.

La mayoría de las líneas de hESC notificadas en todo el mundo hasta la fecha y todas las líneas celulares que figuran actualmente en el registro de los NIH se derivaron de capas alimentadoras de fibroblastos de ratón. Las líneas actuales no serían adecuadas para uso clínico, ya que la selección de donantes y reactivos no cumplía con las normas de la FDA, y la presencia de los comederos para ratones convierte a estas líneas en productos de xenotrasplante. Los problemas de cumplimiento normativo que plantean estas líneas dificultan la obtención de la aprobación de la FDA para su uso en trasplantes humanos.

Para eliminar el uso de comederos de ratón, las hESC no diferenciadas se pueden propagar con éxito en superficies plásticas recubiertas de laminina o Matrigel en presencia de medio acondicionado con fibroblastos embrionarios de ratón (Xu et al 2001). Si bien este sistema evita el contacto directo entre los comederos de ratones y las hESC, no se evita el riesgo de transferencia cruzada de patógenos animales del medio acondicionado para animales a las hESC. Durante los primeros días de desarrollo de nuestras líneas celulares, los investigadores cultivaron con éxito las hESC en alimentadores humanos. Posteriormente, Richards y sus colegas demostraron que los alimentadores de adultos y fetales humanos soportan la propagación indiferenciada prolongada de las líneas hESC existentes y son superiores a las matrices libres de células complementadas con medio acondicionado con alimentador humano o de ratón. También informaron sobre la derivación de una nueva línea hESC utilizando fibroblastos embrionarios humanos y condiciones de cultivo libres de animales (Richards et al., 2002). También se demostró el uso potencial de la placenta humana y los alimentadores derivados del prepucio para desarrollar y apoyar la propagación indiferenciada de hESC (Genbacev et al., 2005; Amit et al., 2003).

Recientemente se informó sobre el mantenimiento de cultivos de hESC no diferenciadas en ausencia de alimentadores. Se demostró que la combinación de LIF, factor de crecimiento de fibroblastos básico y factor de crecimiento transformante Beta1 puede apoyar la proliferación indiferenciada de hESC en fibronectina (Amit et al., 2004). También se sugirió la activación del sistema de señalización Wnt para promover el mantenimiento de hESC pluripotentes en ausencia de alimentadores (Sato et al., 2004). Además, se ha sugerido que sustituir el medio con altas concentraciones de FGF2 y noggin es suficiente para apoyar la propagación de hESCs sin alimentadores (Xu et al., 2005). Además, se informó la propagación indiferenciada sin alimentador de colonias de hESC con un medio químicamente definido sin sustituto de suero, complementado con activina o nodal más FGF2 (Vallier et al., 2005). Por último, se informó sobre la derivación y propagación de hESC en un sistema de cultivo libre de animales, químicamente definido y sin comederos en presencia de altas concentraciones de FGF2 (Ludwig et al., 2006). Hasta el momento, no se informó el desarrollo de hESC en condiciones que permitan su uso futuro para la terapia de trasplante.

En la segunda mitad del proyecto, los investigadores proponen continuar nuestros esfuerzos para desarrollar nuevas líneas de hESC de grado clínico derivadas totalmente de materias primas aprobadas por la FDA en un sistema de cultivo sin animales.

Los comederos de ratón se reemplazarán con líneas celulares primarias de fibroblastos humanos. En la primera parte del proyecto, los investigadores han completado el desarrollo de bancos de células maestras (MCB) de alimentadores de fibroblastos humanos de grado clínico. Estos comederos se produjeron completamente bajo condiciones GMP dentro de la planta de producción de vectores de Hadassah, utilizando materias primas aprobadas por la FDA y libres de animales (para obtener detalles, consulte la sección Resultados). Hasta donde sabemos, otros grupos no informaron sobre el desarrollo de comederos humanos de grado clínico GMP.

Paralelamente, los investigadores han modificado los métodos para la derivación y cultivo de hESCs. Los investigadores han desarrollado nuevos métodos libres de animales para el aislamiento de las células madre pluripotentes de embriones de FIV humanos y han utilizado con éxito estos métodos en la derivación de nuevas líneas hESC. El reemplazo de productos animales y materiales no aprobados por la FDA con materiales de grado clínico humanizados o recombinantes en el sistema de cultivo hESC está casi terminado. La validación de la eficacia del sistema de cultivo modificado está en curso. Los resultados preliminares sugieren que el sistema de cultivo modificado puede admitir de manera eficiente el cultivo no diferenciado de hESC.

Las líneas de hESC de grado clínico recién derivadas se obtendrán utilizando embriones de parejas completamente evaluadas de acuerdo con las pautas y regulaciones de donación de órganos y donación de sangre (según la regla propuesta por la FDA para la idoneidad de los donantes). En el primer año, los investigadores han completado el reclutamiento de 14 embriones de tres parejas. Se revisaron los historiales médicos de los donantes y se obtuvieron y documentaron los resultados de las pruebas de detección de sangre y frotis. Las muestras de sangre de la pareja de donantes se archivaron para realizar pruebas retrospectivas en una instalación de almacenamiento cerrada. El reclutamiento de embriones adicionales está en curso.

Una vez finalizada la caracterización y las pruebas de seguridad de los nuevos alimentadores humanos, su expansión en lotes de trabajo y la validación de la eficacia del sistema de cultivo de grado clínico para hESC, los investigadores desarrollarán las nuevas líneas de hESC en la producción de vectores del Hospital Universitario Hadassah. Instalación, mediante la cual se mantendrán estrictos controles de calidad y pruebas ambientales. Todo el trabajo se realizará utilizando solo materias primas aprobadas por nuestro Programa de control de calidad, proporcionadas por proveedores que se sometieron a un estricto proceso de revisión/aprobación de proveedores. El trabajo de producción se realizará utilizando técnicas que se ajusten a las buenas prácticas de fabricación (GMP) y las buenas prácticas de tejido (GTP).

Los hESC de paso temprano y los alimentadores (Master Cell Bank) se enviarán para pruebas fenotípicas y de agentes latentes, análisis de endotoxinas y pruebas de contaminación viral y de agentes adventicios. El banco de células de trabajo tanto de alimentadores como de hESC también se analizará para caracterización fenotípica, reproducibilidad, esterilidad y micoplasma, detección de agentes latentes y endotoxinas. El producto final se volverá a probar según el Master Cell Bank, mencionado anteriormente.

Al concluir nuestro proceso de fabricación y prueba, el Programa de Células Madre de Hadassah proporcionará un producto comercial genérico. Los procedimientos y métodos que los investigadores han desarrollado serán herramientas fundamentales para otros investigadores de células madre, allanando así el camino para el futuro de la investigación con células madre en Israel y en todo el mundo. El potencial comercial del producto permitirá la producción de células específicas para uso clínico; tendrán un valor comercial generalizado y tendrán un valor de mercado enorme.