Identificación de genes de enfermedades genéticas

Se propone identificar y reclutar individuos y/o familias con los trastornos especificados anteriormente. Se recolectarán 10-20 ml (2-4 cucharaditas) de sangre periférica de todos los sujetos adultos. Se recolectarían volúmenes más pequeños de sangre de niños en función de su edad/tamaño. En algunos casos, como alternativa adecuada a la recogida de sangre periférica, se recogerán células bucales mediante hisopos bucales (Epicentre Biotechnologies). Se pedirá a todos los miembros vivos pertinentes de cada pedigrí que participen, de forma gratuita, únicamente con fines de investigación. El ADN genómico se extraerá mediante métodos estándar y se utilizará como plantilla para las reacciones de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los individuos se genotipificarán en los marcadores y se secuenciará el gen candidato.

Esencialmente se utilizarán dos enfoques:

1. Las circunstancias que pueden proporcionar conocimiento de los genes candidatos incluyen revisiones de la literatura, biología de la enfermedad, comprensión de las vías biológicas, reordenamientos cromosómicos, mutantes en organismos modelo, etc. Cuando existen genes candidatos, se propone utilizar pares de cebadores PCR de microsatélites y/o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) enlazados en el ADN de las familias para determinar si existe una segregación conjunta de la enfermedad y los marcadores y, por lo tanto, un vínculo entre el gen de la enfermedad y marcadores mapeados previamente.

   Si la enfermedad parece estar vinculada al gen candidato, se usarán cebadores de PCR que flanquean todos los exones codificantes para amplificar los exones y los límites entre intrones y exones, seguidos de la secuenciación para detectar las mutaciones que causan la enfermedad. Se encuentra disponible un sitio web que permite el diseño de cebadores para amplificar exones de genes candidatos (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway ). Si existe un gen candidato muy fuerte, la secuenciación del gen candidato se realizará en las muestras individuales afectadas sin realizar primero un estudio de ligamiento.

2. Cuando no existen genes candidatos obvios y se ha recolectado una familia de tamaño suficiente, se propone utilizar microarreglos de SNP de Affymetrix para realizar una búsqueda de vinculación en todo el genoma humano. Hemos utilizado este enfoque con éxito antes (Shrimpton et al 2004), utilizando el análisis de enlace del genoma completo con el Human Mapping 10K Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). El 10K Array permite el genotipado simultáneo de más de 11.200 SNP mapeados espaciados a lo largo del genoma humano en intervalos de 210 KB. Los arreglos Affymetrix 100K y 500K también están disponibles. La información del genotipo SNP se analizará utilizando el software Varia (Silicon Genetics) y/o Merlin. Los datos se utilizarán para definir una región crítica. Si se detecta una segregación estadísticamente significativa, los genes candidatos dentro de la región crítica se evaluarán y clasificarán en orden de probabilidad de ser el gen de la enfermedad. A continuación, los genes candidatos se secuenciarán como se ha detallado anteriormente.

Resumen.

1. Identifique genes de enfermedades candidatos a partir de estudios de ligamiento, pruebas circunstanciales sólidas o pistas del fenotipo.
2. Secuenciar genes candidatos para detectar mutaciones causantes de enfermedades.
3. Evaluación de la variación detectada.