Efecto del bezafibrato sobre el metabolismo muscular en pacientes con defectos de oxidación de ácidos grasos (Bezafibrate)

Antecedentes y objetivo de la investigación:

Las deficiencias de carnitina palmitoiltransferasa II (CPTII) y acil-CoA-deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD) son los dos trastornos hereditarios más comunes de la oxidación de ácidos grasos mitocondriales (FAO) en adultos, ambos heredados de forma autosómica recesiva. La FAO mitocondrial juega un papel fundamental para mantener la homeostasis energética en situaciones como el ayuno, la fiebre o el ejercicio prolongado que requieren tanto ahorro de glucosa como un mayor suministro de energía. En estas situaciones, una serie de tejidos como el músculo esquelético, el corazón y el hígado favorecen a los ácidos grasos como principal fuente de energía. Los ácidos grasos de cadena larga (LCFA), que representan la mayor parte de los ácidos grasos libres endógenos, no pueden ingresar al compartimiento de la matriz mitocondrial por difusión simple, y la transferencia de LCFA a través de las membranas mitocondriales está gobernada por un sistema multienzimático llamado carnitina palmitoiltransferasa (CPT). formado por dos enzimas: CPT I y II. CPT I, un paso regulador clave de la oxidación de LCFA, se encuentra dentro de la membrana mitocondrial externa, mientras que CPT II se adjunta a la cara interna de la membrana mitocondrial interna. Los CPT I y II catalizan una sola reacción (carnitina + acil-CoA ⇔ acilcarnitina + CoA~SH) en las direcciones directa e inversa, respectivamente. VLCAD se une a la membrana mitocondrial interna y cataliza el primer paso de la espiral de oxidación β de ácidos grasos de cadena larga (Izai et al., 1992).

Se han descrito varios fenotipos de deficiencias de CPT II y VLACD. Se pueden presentar síntomas clínicos neonatales o infantiles graves que amenazan la vida con hipoglucemia hipocetósica, insuficiencia hepática y miocardiopatía durante los primeros meses o años de vida (Demaugre et al, 1991; Bonnefont et al, 1996; Vianey-Saban et al. 1998; Andresen et al., 1999). Por el contrario, las formas "adultas" de estas enfermedades son más prevalentes y tienen una expresión clínica restringida al músculo esquelético. En la última forma, el inicio ocurre con mayor frecuencia en adolescentes o adultos jóvenes, y se caracteriza principalmente por episodios recurrentes de rabdomiolisis desencadenados por ejercicio prolongado, ayuno, resfriado o fiebre (DiMauro et al., 1973; Vianey-Saban et al. 1998) . La principal complicación potencial es la insuficiencia renal aguda después de los ataques de rabdomiolisis.

Los estudios de utilización de combustible en sujetos con deficiencias de CPT II y VLCAD, con isótopos estables durante el ejercicio, han demostrado que la oxidación in vivo de LCFA se vio gravemente afectada durante el ejercicio prolongado de baja intensidad. Estos hallazgos indicaron que las actividades residuales de CPT II y VLCAD son suficientes para mantener la oxidación normal de grasas en reposo, pero que la tasa de oxidación de grasas no puede aumentar por encima del nivel basal durante el ejercicio (Ørngreen et al., 2004; 2005).

Los tratamientos recomendados actualmente para los trastornos de la FAO de cadena larga se basan esencialmente en enfoques dietéticos, con restricción de la ingesta de grasas de cadena larga junto con el suministro de triglicéridos de cadena media (aceite MCT). Una dieta rica en carbohidratos también mejoró la tolerancia al ejercicio en pacientes con deficiencia de CPT II, ​​como lo indica la disminución del esfuerzo percibido y una mayor duración del ejercicio después de dicha dieta (Ørngreen et al., 2003). Más recientemente, se produjo una mejora notable de los síntomas cardíacos y musculares en tres niños con deficiencia de VLCAD, después de la suplementación dietética con un ácido graso de cadena media de siete carbonos (triheptanoína). Se cree que el mecanismo que subyace a este efecto implica la producción de cuerpos cetónicos C5 y propionil-CoA, lo que permite reponer el conjunto de intermediarios catalíticos para el ciclo del ácido cítrico (Roe et al., 2002). Este enfoque prometedor todavía está bajo evaluación y los marcados efectos secundarios digestivos podrían restringir su indicación hacia la forma más grave de los defectos de la FAO. Los enfoques farmacológicos son principalmente la suplementación con carnitina para proporcionar carnitina para convertir acil-CoA de cadena larga potencialmente tóxicos en acilcarnitinas. Sin embargo, el papel de los suplementos de carnitina en los defectos de la FAO sigue siendo controvertido y de valor no probado debido a la ausencia de ensayos controlados.

Los receptores PPARα se identificaron como objetivos potenciales para la terapia farmacológica de las deficiencias de CPTII y VLCAD. PPARα es un factor de transcripción, perteneciente a la superfamilia de receptores de hormonas tiroideas esteroides, que es capaz de modificar la expresión génica de CPT2 y VLCAD (Lemberger et al, 1996). Djouadi et al. establecieron que la administración a ratones de control de un inhibidor de CPT I (etomoxir) provoca una inducción de retroalimentación de genes diana PPARα implicados en la oxidación de ácidos grasos, como los genes de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media y acil-CoA oxidasa (Djouadi et al, 1998). También se demostró que PPARα regula la expresión constitutiva del gen y la proteína CPT2 en el corazón y el hígado de ratones adultos y media en la regulación positiva del gen CPT2 en respuesta a los fibratos en el hígado de ratones (Aoyama et al, 1998, Watanabe et al, 2000). ). En humanos, la clase de fármacos hipolipemiantes "fibratos" (clofibrato, bezafibrato, gemfibrozilo, etc.) son ligandos específicos de PPARα y la interacción con PPARα forma la base molecular de los efectos terapéuticos de estos fármacos (Vamecq et al, 1999). El grupo de investigación de Bastin J y Djouadi F planteó la hipótesis de que el fármaco hipolipemiante bezafibrato, que actúa como activador de PPARα, podría estimular la FAO en líneas celulares deficientes en CPT II y VLCAD. Se demostró que el tratamiento con bezafibrato de fibroblastos de cuatro pacientes con deficiencia de CPT II con la forma "adulta" de la enfermedad 1) aumenta la cantidad de ARNm de CPT2 (+ 47 % a + 66 %) y la actividad residual de la enzima CPT II (+ 54 % a + 135 %) de manera dependiente del tiempo y la dosis, y 2) para normalizar las tasas de oxidación de 3H-palmitato y 3H-miristato. Por el contrario, el bezafibrato no corrigió la FAO en dos pacientes con la forma "infantil" de deficiencia de CPTII (Djouadi et al, 2003). Dado que la expresión clínica de la forma "adulta" de la deficiencia de CPT2 está restringida al músculo esquelético, se probó el efecto de los fibratos sobre la FAO en muestras de músculo de dichos pacientes. Después de recibir muestras de músculo de pacientes con la forma "adulta" de deficiencia de CPTII seguidos en el Instituto de Miología (P. Laforêt, B. Eymard), se ha demostrado que los mioblastos de estas biopsias exhibieron una disminución del 40 % en FAO en comparación con las células de control (Djouadi et al, 2003). Además, el pretratamiento de mioblastos deficientes en CPTII con bezafibrato restauró la FAO a niveles normales (Bastin et al, 2003).

Más recientemente, Djouadi et al. (2005) demostraron que la adición de bezafibrato en el medio de cultivo indujo un aumento dependiente de la dosis (hasta 3 veces) en la capacidad de oxidación del palmitato en fibroblastos de pacientes con la forma miopática de deficiencia de VLCAD, pero no en pacientes gravemente afectados. Esta mejora biológica se relacionó con aumentos inducidos por el fármaco en ARNm de VLCAD (+ 44 a + 150 %), proteína (1,5-2 veces) y actividad enzimática residual (hasta 7,7 veces) en las células de los pacientes. El bezafibrato también disminuyó la producción de acil-carnitinas de cadena larga en un 90 % en células que albergaban una deficiencia moderada de VLCAD. El mismo grupo también investigó la respuesta al bezafibrato en función del genotipo en 33 fibroblastos deficientes en VLCAD que representan 45 mutaciones diferentes. El tratamiento con bezafibrato dio como resultado un marcado aumento de las capacidades de la FAO, lo que a menudo conduce a la restauración de los valores normales, para 21 genotipos que corresponden principalmente a pacientes con el fenotipo miopático (Gobin-Limballe et al., 2007).

Situación del área de investigación y resultados del investigador en esta área Los datos anteriores proporcionaron la primera evidencia de un posible efecto farmacológico de los agonistas de PPAR sobre los defectos de la FAO en humanos. En los últimos dos años, se ha realizado un ensayo clínico piloto que evalúa los posibles efectos beneficiosos del bezafibrato en la forma muscular de la deficiencia de CPT II en colaboración entre los hospitales Pitié-Salpêtrière y Necker (appel d'offre AFM 2004). Seis pacientes adultos con deficiencia de CPT II recibieron una dosis diaria de 400 mg de bezafibrato durante 6 meses. La tolerancia clínica al tratamiento fue excelente, y los síntomas musculares mejoraron en 5/6 pacientes con disminución de la intensidad y duración de las mialgias. Se llevaron a cabo análisis in vitro en linfocitos y músculo esquelético, muestreados antes y al final del estudio. LCFAO en mitocondrias musculares aisladas se indujo fuertemente en 6/6 pacientes, y se demostró que este efecto es el resultado de la regulación positiva inducida por fármacos de los niveles de proteína y ARNm de CPT2 (Djouadi et al., 2007). Sin embargo, los criterios de valoración principales de este estudio fueron principalmente el análisis bioquímico, y no pudimos demostrar claramente una disminución en la frecuencia de los ataques de rabdomiolisis, ni una mejora del metabolismo muscular in vivo.

Proponemos evaluar el efecto del bezafibrato sobre el metabolismo durante el ejercicio en pacientes adultos afectados por deficiencias de CPT II o VLCAD. Este estudio será un ensayo cruzado, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, de 11 meses de duración. El ensayo se llevará a cabo en dos centros: Institut de Myologie, Hospital Pitié-Salpêtrière en Francia y Unidad de Investigación Neuromuscular, Rigshospitalet, Universidad de Copenhague, en Dinamarca. Dado que la prueba de ejercicio en cicloergómetro después de la infusión de isótopos estables es probablemente la forma más confiable de evaluar la oxidación de grasas in vivo, esta técnica se utilizará como uno de los dos resultados principales de este estudio y el criterio principal para evaluar el efecto potencial de este El fármaco será la tasa de oxidación de grasas durante una carga de trabajo moderada en cicloergómetro.

Los dos resultados principales para evaluar el efecto potencial del bezafibrato son:

• Oxidación de grasas y frecuencia cardiaca generada durante la actividad física en cicloergómetro con carga de trabajo constante.

Esperamos que la oxidación de grasas en los pacientes aumente en un factor de 1,7.

Resultados secundarios:

• Actividad enzimática en leucocitos
• Perfil de acilcarnitina
• Acelerómetro
• Puntuación de Borg (esfuerzo percibido)
• Número de episodios de mioglobinuria
• Puntaje diario de dolor muscular (EVA)
• Diario de utilización de energía (cuestionario de Bouchards)

Material y métodos:

Sujetos Este estudio será un ensayo cruzado, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, de 9 meses de duración. Según el cálculo de la fuerza en la sección de estadísticas, se incluirán en el estudio 22 pacientes, respectivamente 11 pacientes con CPT II y 11 pacientes con deficiencia de VLCAD:

Las formas adultas de deficiencias de CPTII y VLCAD son enfermedades muy raras. Veinticinco pacientes con deficiencia de CPTII y 15 pacientes con la forma miopática de deficiencia de VLCAD se siguen actualmente en nuestros dos grupos. En caso de que no podamos incluir suficientes pacientes de Dinamarca y Francia, incluiremos pacientes de nuestros colaboradores en los Países Bajos y Suecia. Todos los estudios se realizarán en el Rigshospitalet y el Hospital Pitié-Salpêtrière. Solo las muestras de sangre periódicas se subcontratarán a otros hospitales, pero los resultados se enviarán por fax o por correo directamente al patrocinador oa los investigadores.

El estudio se realizará en los dos centros:

1. Neuromuskulær Forskningsenhed, Rigshospitalet, Dinamarca
2. Institut de Myologie, Hospital Pitié-Salpêtrière, Frankrig En colaboración con
3. Farmacia de la región de Copenhague, Alice Rosendahl, Marielundvej 25, Herlev, Dinamarca
4. Centro de Investigación Muscular de Copenhague, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, København Ø, Dinamarca
5. Unidad GCP, hospital Bispebjerg, Bispebjerg Bakke 23, København NV, Dinamarca

El estudio se divide en cuatro períodos:

• Primer período: período de observación de 1 mes.
• Segundo período: 3 meses de tratamiento con bezafibrato o placebo.
• Tercer período: 2 meses de lavado.
• Cuarto período: 3 meses de tratamiento con bezafibrato o placebo (el fármaco opuesto al del segundo período).

Los pacientes deben completar puntajes diarios de dolor muscular (puntaje VAS) y utilización de energía (cuestionario de Bouchards) durante los cuatro períodos.

Primer periodo:

1. Antes de la aleatorización, todos los pacientes tienen un período de observación de 1 mes.
2. La creatina quinasa se medirá regularmente en este período para definir el nivel de daño muscular antes del tratamiento.
3. Para determinar una carga de trabajo del 50 % del consumo máximo de oxígeno (VO2max) para el experimento, todos los sujetos completarán una prueba de ejercicio en bicicleta incremental máxima en un cicloergómetro al final de este período.

Segundo y cuarto período:

1. Se indicará a los sujetos que sigan una dieta rica en carbohidratos estandarizada tres días antes del experimento que contenga 65 % de carbohidratos, 15 % de proteínas y 20 % de grasas.
2. Estudio de oxidación de grasas: después del período de observación de 3 meses, los sujetos se reunirán en el laboratorio a las 9:00 a. m. Se insertarán dos catéteres en las venas del brazo, uno en la vena cubital para la infusión de isótopos estables y otro en la vena cefálica distal para la toma de muestras de sangre. Los sujetos recibirán una infusión preparada a velocidad constante de [U-13C]-palmitato (0,0026 mg kg-1 min-1, preparado con un bolo de 0,085 mg kg-1 de NaH13CO3, ¡NOTA!, trazadores no radiactivos y no peligrosos) . Dos horas después del inicio de la infusión de isótopos, los sujetos pedalearán hasta el agotamiento o durante un máximo de 60 min. con una carga de trabajo del 50-60 % del VO2máx determinado previamente. La frecuencia cardíaca y el nivel de esfuerzo percibido (escala de Borg) se controlarán cada dos minutos durante el ejercicio. La sangre y los gases espirados para las mediciones de isótopos se recolectarán a intervalos de 10 minutos en reposo y durante el ejercicio. El aire espirado se recolectará en una bolsa Douglas de 15 L y se inyectarán muestras de aire de 10 ml de las bolsas en tubos vacutainer para análisis de enriquecimiento de 13CO2. Se recogerán muestras de sangre para acil carnitinas después de 30 y 60 min. de ejercicio o al agotamiento, y tres horas después del ejercicio. La actividad enzimática de CPT II y VLCAD se medirá en leucocitos. La prueba descrita anteriormente se ejecutará tanto antes como después de cada período de tratamiento.
3. Los pacientes serán aleatorizados en dos grupos, para recibir 3 x 200 mg de bezafibrato o placebo en el segundo período y viceversa en el cuarto período. Los pacientes y todo el personal sanitario están cegados al tratamiento. La aleatorización la lleva a cabo la farmacia regional certificada por GMP de Copenhague.
4. En el primer día de prueba de estos dos períodos, se tomarán muestras de sangre de los pacientes para analizar la creatincinasa, el colesterol, los triglicéridos, las lipoproteínas, los ácidos grasos de cadena larga totales, la carnitina total, las acilcarnitinas, la bilirrubina, la creatinina, la aspartato aminotransferasa (ASAT), la alanina amino transferasa (ALAT), γ glutamil transferasa y fosfatasa alcalina.
5. Para indicar su nivel de actividad, los pacientes llevarán un acelerómetro los últimos catorce días de cada periodo de tratamiento.

Tercer periodo:

1. Período de lavado de dos meses.
2. Mediciones de los niveles de creatina quinasa cada dos semanas.

análisis estadístico

Cálculo de fuerza:

Doble ciego, aleatorizado y cruzado:

(z1-α/2 + Z1-β )2 * SD2 n ≥ _________________________ d2

Z1-a/2 = 1,96; Riesgo de error tipo 1 (α=0,05) Z1-β = 0,84; Riesgo de error tipo 2: (1-β) = 80% SD2 = 1,25; oxidación del palmitato delta en cuatro pacientes con deficiencia de CPT II = 1,26±1,12 (Ørngreen et al, 2005) d2 = 0,87; (MIREDIF) aumento en la oxidación del palmitato durante el ejercicio desde el nivel de los pacientes con doble mutación del gen CPT2 hasta el nivel de los sujetos con una sola mutación del gen CPT2. (Ørngreen et al, 2005).

(1.96 + 0.84 )2 * 1.25 n ≥ _________________________ = 11 0.87

El cálculo de la fuerza se basa en un estudio anterior de oxidación de grasas en pacientes con deficiencia de CPT II. Ørngreen et al 2005 En este estudio describimos la oxidación de grasas de pacientes y portadores con respectivamente dos y una mutaciones del gen CPT2 en comparación con la oxidación de grasas en controles sanos. Se espera que el efecto esperado de bezafibrato sobre la oxidación de grasas en pacientes con CPT II sea la diferencia entre el valor medio de oxidación de grasas en pacientes con deficiencia de CPT II y el valor medio de oxidación de grasas en portadores heterocigóticos de una mutación del gen CPT2. El cálculo de la fuerza indica que es necesario incluir un número de 11 sujetos. El objetivo es incluir 11 pacientes de, respectivamente, los grupos de pacientes con deficiencia de CPT II y los grupos de pacientes con deficiencia de VLCAD. Si de alguna manera resulta que no podemos incluir tantos pacientes. Los dos grupos se agruparán en un solo grupo. Esto se puede hacer debido a la similitud de los dos grupos tanto en los síntomas como en la oxidación de grasas, que es uno de los resultados primarios, durante el ejercicio. al menos un período de tratamiento, los resultados se incluirán en los datos. Las diferencias entre los tratamientos en el individuo se evaluarán mediante una prueba t de Student pareada. Un valor de p < 0,05 (prueba de dos colas) se considerará significativo.

Pacientes

Criterios de inclusión:

1. Disminución significativa en las actividades de CPT II o VLCAD medidas en linfocitos o fibroblastos, junto con verificación genética de deficiencia de CPT II o deficiencia de VLCAD.
2. Hombres y mujeres de 18 a 65 años.
3. Todas las hembras fértiles deben tener una prueba de embarazo negativa y usar anticoncepción durante el período de estudio.

Criterio de exclusión:

1. Ingestión de fármacos competitivos, como se describe en el resumen del producto de bezafibrato.
2. Trastornos competitivos, evaluados por el patrocinador o investigadores
3. Embarazo o lactancia durante el período de terapia con fibratos

Parámetros de seguridad:

• CK antes y cada dos semanas ± una semana durante el período de tratamiento.
• Enzimas hepáticas (AST, ALT, γGT, fosfato alcalino), bilirrubina, creatinina, colesterol, triglicéridos antes del período de tratamiento, a 1 mes ± una semana y al final del período de tratamiento. Se tomarán muestras de sangre en los hospitales locales y los resultados se enviarán por fax al patrocinador oa los investigadores.
• Se informará a todos los pacientes que se comuniquen con uno de los médicos involucrados en caso de: 1) síntomas de su enfermedad o 2) efectos secundarios del tratamiento.

Se siguen los siguientes pasos para garantizar el cumplimiento de los pacientes durante los períodos de tratamiento.

• Los pacientes serán contactados semanalmente por correo o teléfono, para asegurar que se siga el tratamiento y que no haya síntomas de la enfermedad o efectos secundarios del tratamiento.
• En caso de que uno de los pacientes olvide seguir la prescripción de los medicamentos, el período de tratamiento se prolongará previa evaluación del patrocinador o investigadores.

Drogas:

En este estudio utilizamos el fibrato Bezafibrato. Para obtener información detallada sobre el efecto y los efectos secundarios, consulte el archivo adjunto con el resumen del producto de Bezafibrato.

Aleatorización y desenmascaramiento: todos los medicamentos se entregan de forma enmascarada y aleatoria desde la farmacia. En caso de que se produzcan efectos secundarios del tratamiento que pongan en peligro la vida u otros efectos secundarios inaceptables, se puede desenmascarar al paciente después de la decisión del patrocinador o el investigador. La lista de aleatorización estará a cargo de la secretaria Malene Kronborg Have y la MD Tina Dysgaard Jeppesen en Dinamarca. Estas dos personas están disponibles las 24 horas del día y, de lo contrario, no participan en el estudio.