Papel de las micropartículas en la coagulopatía de la leucemia promielocítica aguda

Los investigadores planean medir los parámetros de laboratorio de rutina de coagulación y fibrinólisis, la actividad procoagulante o profibrinolítica de las micropartículas (MP), y explorar el papel del factor de activación procoagulante y profibrinolítico de las MP en la patogenia de la coagulopatía en pacientes con APL.

i. Turbidimetría dinámica de la formación de coágulos de plasma. Los efectos de las MP sobre la cinética de formación de fibrina y sobre las propiedades ópticas de los coágulos se estudian mediante turbidimetría dinámica de muestras de plasma recalcificado (plasma libre de plaquetas y plasma empobrecido en micropartículas) sin añadir ningún activador de la coagulación. Después de la coagulación de las muestras de plasma inducida por Ca2+, se controla la densidad óptica a λ = 405 nm a 37 °C.

ii. Ensayo de generación de trombina. La cantidad de trombina formada en el plasma tras la recalcificación se mide directamente mediante una prueba de generación de trombina modificada. Debido a que la fibrina interfiere con las mediciones colorimétricas, las muestras de plasma primero se desfibrinan agregando reptilasa y luego se incuban a 37 °C. Se eliminan los coágulos. Luego se agrega un sustrato cromogénico para la trombina a las muestras de plasma. La generación de trombina se inicia añadiendo CaCl2 con registro simultáneo de la absorbancia a λ = 405 nm.

iii. Capacidad de generación de trombina de las MP. Las MP se reconstituyen en plasma normal desfibrinado (tratado con reptilasa), combinado y sin micropartículas. Luego se agrega a las muestras un sustrato cromogénico para la trombina. La generación de trombina se inicia añadiendo CaCl2 con registro simultáneo de la absorbancia a λ = 405 nm.

IV. Experimentos inhibidores de la generación de trombina. Los siguientes inhibidores se incuban previamente con las micropartículas: anexina V, factor tisular antihumano (TF) e inmunoglobulina G (IgG) de control irrelevante. Luego repite el experimento iii.

v. Actividad fibrinolítica. Incube una concentración fija de plasminógeno con las muestras de plasma en presencia de un sustrato cromogénico selectivo para plasmina. La plasmina formada a partir del plasminógeno unido a la superficie de las micropartículas escinde el sustrato cromogénico y la p-nitroanilina liberada se detecta midiendo A405nm en función del tiempo.

vi. Determinación de la actividad fibrinolítica sobre micropartículas. La capacidad de las micropartículas para activar el plasminógeno se determina incubando una concentración fija de plasminógeno (1 mM) con las micropartículas con o sin t-PA y/o u-PA en presencia de un sustrato cromogénico selectivo para plasmina. La plasmina formada a partir del plasminógeno unido a la superficie de las micropartículas escinde el sustrato cromogénico y la p-nitroanilina liberada se detecta midiendo A405nm.

vii. Experimentos inhibidores de la actividad fibrinolítica. Los siguientes inhibidores se incuban previamente con las micropartículas: activador del plasminógeno de tipo tisular antihumano (tPA), activador del plasminógeno de tipo uroquinasa antihumana (uPA) y las respectivas IgG de control irrelevantes; Ácido ε-aminocaproico e inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1). A continuación, repetir el experimento vi.