Estudio de Células Madre Inducidas por Enfermedades Neurodegenerativas en Pacientes y Controles Familiares Sanos. (NeuronsiPS)

1. INTRODUCCIÓN Las enfermedades neurológicas y neurodegenerativas tienen un gran impacto en las familias y en el sistema nacional de salud debido a la falta en muchos casos de terapias efectivas y duraderas. La falta de estas estrategias terapéuticas se debe en gran parte a la dificultad de modelar estas patologías in vitro. De hecho, la imposibilidad de poder cultivar neuronas humanas in vitro ha obligado a utilizar modelos de células animales que no recapitulan adecuadamente la complejidad de estas patologías humanas. Por ello es necesario proceder al desarrollo de modelos in vitro de origen humano que reproduzcan las características moleculares y bioquímicas de estas enfermedades.

   El descubrimiento de la reprogramación celular permitió generar células madre pluripotentes a partir de la conversión de células somáticas extraídas de individuos adultos. Esta tecnología se basa en la expresión de los 4 genes OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC que sinérgicamente son suficientes para convertir células somáticas en células madre inducidas denominadas iPS (1,2). Por esta tecnología, el Prof. S. Yamanaka de la Universidad de Kyoto recibió el Premio Nobel de Medicina en 2012 (3). Las células madre humanas inducidas por iPS pueden mantenerse in vitro de manera estable a lo largo del tiempo y luego diferenciarse en cualquier célula especializada, incluidas las neuronas y las células gliales. De esta forma, por tanto, es posible generar neuronas humanas a partir de individuos adultos que padecen patologías neurológicas, permitiendo el estudio de mecanismos fisiopatológicos en células afectadas por estas enfermedades. La investigación en los últimos años ha establecido muchos protocolos confiables para diferenciar las células iPS humanas en diferentes subtipos de neuronas (glutamatérgicas, GABAérgicas, dopaminérgicas), astrocitos, oligodendrocitos y microglía (4-6). Gracias a estos procedimientos fue posible generar modelos neuronales y gliales de muchas enfermedades neurológicas creando sistemas muy útiles para estudiar procesos patológicos e identificar nuevas dianas terapéuticas para algunas formas genéticas de Alzheimer, Parkinson y autismo (7-9).

   El grupo proponente ya tiene una gran experiencia en generar células iPS por reprogramación y en diferenciarlas en neuronas y glías útiles para estudios celulares de enfermedades neurológicas. Como ejemplo, el grupo del Dr. Broccoli ha generado células iPS de pacientes con enfermedad de Parkinson y mutaciones en el gen OPA1 (8). El estudio de las neuronas diferenciadas por estas células iPS permitió identificar defectos mitocondriales en la base de las disfunciones neuronales e identificar por primera vez cómo la degeneración de las neuronas dopaminérgicas también depende de un modo móvil de muerte celular llamado necroptosis (8).

   Por ello, los investigadores proponen establecer líneas de células iPS de pacientes con mutaciones genéticas responsables de enfermedades neurológicas y neurodegenerativas para generar modelos neuronales y gliales in vitro para el estudio de mecanismos patológicos y la validación de nuevas terapias experimentales futuras.

2. PROPÓSITO Y DIBUJO DEL ESTUDIO El objetivo de este estudio es generar líneas de células madre inducidas por iPS de pacientes con enfermedades neurológicas y neurodegenerativas para diferenciarse en neuronas y células gliales para estudiar los procesos celulares y moleculares patológicos de estas enfermedades. Estos cultivos in vitro también se utilizarán para validar moléculas o enfoques terapéuticos experimentales. Las células IPS se generarán mediante la reprogramación de células aisladas de 10 ml de sangre venosa periférica.

Por lo tanto, el estudio consiste en tomar 10 ml de sangre periférica de

1. Sujetos portadores de mutaciones genéticas que condicionan el desarrollo de enfermedades neurológicas y/o neurodegenerativas.
2. Familiares o familiares de control no portadores de mutaciones genéticas que condicionan el desarrollo de enfermedades metabólicas y/o neurodegenerativas (donantes sanos).

3. FASE EXPERIMENTAL

1. Tras una visita Neurológica, se solicita una Consulta Neurológica por parte del Neurólogo.
2. Se realiza Consejo Genético y se identifica la prueba molecular a realizar. Las vías clásicas de diagnóstico se aplican según las guías nacionales específicas para cada patología (SIGU: http://www.sigu.net/show/attivita/5/1/LINEE%20GUIDA%20SIGU) que indican el análisis de los más idóneos para analizar y sobre todo los más frecuentemente implicados.
3. Se toma una muestra de sangre después de firmar un formulario de consentimiento informado (consentimiento informado Neuromed versión 12.02.2015) para el estudio diagnóstico. Se tomarán aproximadamente 10 mililitros de sangre y posteriormente se fraccionará una parte en suero y linfocitos que se almacenarán a -80°C.
4. Los análisis moleculares se realizan en el Centro de Genética Molecular del Instituto Neuromédico IRCCS INM mediante NGS o Secuenciación de Sanger, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) y Microsatélites.
5. Si el diagnóstico molecular ha identificado un gen y/o una variante de interés compatible con el fenotipo clínico, o ha identificado una variante con significado clínico incierto (VoUS), se evalúa en objeto la importancia científica real de generar las células madre iPS del paciente.
6. Si se evalúa positivamente la posibilidad de generar tales células, durante la consulta, al mismo tiempo que se retira el informe, se solicita al paciente su consentimiento (consentimiento informado Neuromed versión 12.02.2015) para participar en este protocolo de investigación. Se toma una muestra de sangre periférica de 10 ml.
7. Las muestras de sangre en tubos con EDTA como anticoagulante se envían por mensajería urgente al laboratorio de la Dra. Vania Broccoli en el Hospital San Raffaele (OSR) donde las células mononucleares de la sangre serán reprogramadas en células madre iPS.
8. Parte de las células madre iPS generadas en OSR serán enviadas al NEUROMED para confirmar la mutación patológica y la correcta genética celular
9. Las células madre iPS se diferenciarán en neuronas y glía para el estudio de los mecanismos patológicos subyacentes a la neuropatología.
10. Se criopreservarán alícuotas de células madre iPS en nitrógeno líquido tanto en OSR como en NEUROMED para asegurar el mantenimiento de las líneas que se mantendrán hasta el final del estudio.

4. MATERIALES Y MÉTODOS Reprogramación de células mononucleares de sangre periférica Una vez obtenidos los 10 ml de sangre venosa periférica, se aislarán y reprogramarán células mononucleares (PBMCs) mediante el virus Sendai RNA, que expresa los 4 genes SOX2, OCT4, KLF4 y c -MYC sin integrarse en el genoma celular. Esta operación se realizará en salas estériles BL2 disponibles en el laboratorio de la Dra. Vania Broccoli en la División de Neurociencia del Hospital San Raffaele de Milán.

Luego, las PBMC se sembrarán en placa sobre una estera de fibroblastos en placas Petri estériles de 10 mm con un medio de cultivo enriquecido con la citocina bFGF (4 ng/ml) (8). En estas condiciones de cultivo, los primeros clones de células madre reprogramadas iPS serán visibles después de aproximadamente 30 días. En este punto, los clones individuales serán aislados y cultivados para aumentar el número de células y establecer líneas de proliferación. Se estudiará la progenie de los clones individuales para verificar la correcta reprogramación en células madre pluripotentes a través de: 1) activación de genes marcadores del estado de estaminalidad pluripotente (Nanog, Sox2, Oct4, SEEA4), capacidad de diferenciación in vitro en el somático células de las tres láminas embrionarias de endodermo, mesodermo y ectodermo, mínima contaminación de células diferenciadas en el cultivo. Una vez que se haya validado la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS), las células se utilizarán para diferenciarse en diferentes tipos neuronales y gliales para experimentos destinados a comprender y describir los mecanismos patogénicos de las enfermedades del sujeto de estudio. Para la generación de neuronas se seguirá el protocolo desarrollado por Shi y colaboradores (5) que utiliza ácido retinoico e inhibidores de proteínas TGFbeta/BMP para dirigir la diferenciación neuroectodérmica. Este procedimiento ya ha sido validado y utilizado en nuestros laboratorios demostrando la diferenciación de células madre iPS en neuronas maduras y funcionales (10) (Figura 1).

Una vez establecidos los procesos de diferenciación con células madre iPS, los investigadores procederán al análisis del fenotipo en las células de los pacientes respecto a controles derivados de controles sanos. En particular, en lo que respecta a los análisis en neuronas, se investigarán parámetros de supervivencia, actividad neuronal a través de registros electrofisiológicos, morfología y metabolismo mitocondrial, estrés del retículo endoplásmico y formación y funcionamiento de sinapsis. Para las células gliales, se analizarán los niveles de inflamación, incluida la actividad de las proteínas TNF-alfa, IL-1beta, IL-4, IL-6 y NOS. Junto a estos estudios, se realizará un análisis genómico comparando los perfiles de expresión génica de neuronas y células gliales. El análisis se realizará para RNA-Seq, una técnica de "secuenciación de última generación" que permite analizar los niveles de expresión de todos los genes del genoma. Los genes así identificados se validarán con análisis PCR en tiempo real y se investigará su funcionamiento en neuronas y células derivadas de las células del paciente.

5. ESTADÍSTICAS Para el estudio de procesos patológicos se derivarán 6 líneas de células iPS de cada paciente e individuo sano. Los investigadores anticipan por nuestra experiencia previa que la comparación entre este número de líneas entre paciente y donante sano es más que suficiente para tener significación estadística para los diferentes experimentos in vitro que se realizarán. En caso de que sea posible generar nuevas líneas de células iPS del mismo paciente en el improbable caso de que fuera necesario.

6. ASPECTOS ÉTICOS Los procedimientos informados en el estudio con respecto a la realización, la realización y la documentación están diseñados para garantizar que se respeten los principios éticos establecidos en la Declaración de Helsinki y sus revisiones. El estudio se realizará teniendo en cuenta los requisitos reglamentarios y las obligaciones legales. En particular, la referencia normativa está representada por el DL n.211, 24/06/2003 y DM 17/12/2004 sobre estudios sin fines de lucro. Además, antes de la inscripción, todos los pacientes potencialmente elegibles recibirán información completa y completa sobre el estudio. Para ser inscrito será necesario que los pacientes consientan en la participación en el estudio y tratamiento de datos personales, según la ley 196/03 sobre la protección de las personas y el tratamiento de datos personales. Se utilizará el consentimiento informado previamente aprobado por el comité de ética.

7. OBJETIVOS FINALES Este programa pretende identificar los procesos subcelulares alterados exactamente en células humanas (neuronas e i) afectadas por las neuropatologías en cuestión. Además, este estudio también nos permitirá integrar datos moleculares con el objetivo de identificar genes cuyas alteraciones específicas puedan ser la base de estas disfunciones celulares. El objetivo último de este programa experimental es identificar la alteración de mecanismos moleculares específicos que subyacen a estas enfermedades. Estos nuevos conocimientos serán fundamentales para pensar en el desarrollo de nuevas estrategias traslacionales basadas en enfoques farmacológicos o terapia génica. Esto es de gran importancia ya que las enfermedades en cuestión son huérfanas de tratamiento efectivo y se limitan a tratamientos exclusivamente sintomáticos.

8. COSTOS DEL PROYECTO El diagnóstico molecular se realiza de manera rutinaria en el Centro de Genética Molecular del IRCCS Neuromed. No hay costes adicionales ya que los análisis son parte de los procedimientos de diagnóstico realizados de acuerdo con el SNS.

La generación de IPS es realizada por IRCCS San Raffaele. Los costos para el desarrollo de estas líneas, por lo tanto, dependen completamente de ellos.