Metilación del ADN en niños y adolescentes con diabetes mellitus tipo 1 (METHYLDIAB) (METHYLDIAB)

La diabetes mellitus tipo 1 (DM1) es una enfermedad autoinmune bien estudiada que provoca una deficiencia de insulina debido a la pérdida selectiva de células β. Los factores ambientales y genéticos parecen tener una interacción compleja en individuos genéticamente susceptibles que conducen al desarrollo de DM1.

La epigenética es un nuevo campo de la biología que estudia los cambios heredados en la expresión del ácido desoxirribonucleico (ADN) que no se pueden atribuir a la alteración de la secuencia de ADN a través de la metilación del ADN, la modificación de histonas y los micro-ARN que actúan como reguladores postranscripcionales.

La metilación de los dinucleótidos de citosina - guanosina (CpG), ubicados en la región promotora de los genes, juega un papel vital en la transcripción y expresión génica y se cataliza en la posición 5' de la citosina a través de enzimas llamadas ADN metiltransferasas (DNMT).

Hasta el momento se ha publicado un número limitado de estudios sobre epigenética en pacientes pediátricos con DM1. El propósito del presente estudio es investigar el patrón de metilación de los islotes CpG en las regiones promotoras de genes de susceptibilidad específicos como la proteína tirosina fosfatasa, tipo no receptor 22 (PTPN-22), la insulina (INS) y el antígeno leucocitario humano G (HLA). -G), extraídos de glóbulos blancos (WBC) de T1DM y controles sanos de niños y adolescentes.

Se reclutaron veinte pacientes y veinte controles pareados por edad y sexo. Se obtuvo una historia personal, familiar, gestacional/perinatal detallada y se realizó un examen físico completo en todos los participantes del estudio. Ambos grupos y sus familiares de primer grado no tenían antecedentes de otras enfermedades autoinmunes.

Los padres dieron su consentimiento informado por escrito para la participación de sus hijos, según la declaración de Helsinki para la investigación. involucrando sujetos humanos.

Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Aristóteles de Tesalónica, Tesalónica, Grecia (Protocolo n.º 185/30/12/2015).

Se recogieron muestras de sangre completa de ambos grupos después de un período de ayuno de 12 horas y se almacenaron inmediatamente a -80 oC.

El ADN se extrajo de las muestras de sangre utilizando el kit de extracción de ADN QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN Inc, CA, EE. UU.), según lo sugerido por el fabricante. Las muestras aisladas se cuantificaron espectrofotométricamente utilizando la razón de posibilidades (OD ratio) 260/280 (1 OD = 50 μg/ml), (BioPhotometer 6131 Eppendorf AG, Alemania). El tratamiento con bisulfito se realizó en 300 ng de ADN de cada muestra utilizando el kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research, Methylation-Gold, EE. UU.), según lo recomendado por el fabricante. El tratamiento con bisulfato de sodio convierte las citosinas no metiladas en uracilos, mientras que las citosinas metiladas permanecen sin cambios en las mismas condiciones estables.

Para la amplificación del promotor del gen INS, se usaron cebadores específicos del gen de la siguiente manera: INS-Forward 5'-TATTTTGGAATTTTGAGTTTATT-3' e INS-Reverse 5'-AACAAAAATCTAAAAACAACAA-3', para PTPN-22-Forward 5'-TTTTGGTTTATGTTGTAGAGT -3΄ y PTPN-22 Reversa 5΄- ATTTTATTTTATTATTTATATGTAA-3' y para HLA-G- Adelante 5'-TAGGGAGTTTAGTTTAGGGAT -3' y Reversa 5'- TTAAGGATGGTGGTTATGG -3'.

Se añadió una secuencia adaptadora saliente adicional a los cebadores específicos de locus para las regiones a las que se apunta (Nextera Transposase Adaptors, Illumina), en el orden de construcción rápida de bibliotecas de secuenciación de próxima generación (NGS). Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplificaron en un instrumento de aumento gradual de temperatura baja, el termociclador 9700 (Eppendorf AG No5341, modo de emulación 9600) utilizando la polimerasa de ADN AmpliTaq Gold.

Después de la purificación de los productos de PCR con microesferas supermagnéticas altamente reactivas, NucleoMag NGS Clean-up and Size Select (Macherey-Nagel. Gato. Número 744970.5.), se agruparon en cantidades molares similares y se enviaron para la construcción de bibliotecas de acuerdo con las instrucciones del fabricante, kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT, Research Illumina.

Para NGS, las lecturas de extremos emparejados se seleccionaron en una formación de longitud de lectura de 2 x 250 pares de bases, en una plataforma MiSeq de Illumina.

Las lecturas de análisis de secuencia se realizaron con archivos FASTQ y el estado de metilación se estimó con la herramienta ampliMethProfiler, una canalización basada en Python para amplicones secuenciados con bisulfito profundo específicos. El estado de metilación se analizó en diez sitios CpG del promotor del gen INS, cuatro sitios CpG de PTPN -22 gen y diecinueve sitios CpG del gen HLA-G alrededor del sitio de inicio transcripcional (TSS).

Los científicos bioinformáticos interpretarán las secuencias y la identificación de los sitios metilados y no metilados.

Se creará una base de datos y todos los datos se someterán a un análisis estadístico. Los resultados y las conclusiones del presente estudio se publicarán en revistas revisadas por pares y se presentarán en reuniones nacionales e internacionales.