Impacto de las bombas en las arterias torácicas internas (IPITA) (IPITA)

OTRO: Grupo bomba de rodillos

La CABG se realizó bajo circulación extracorpórea (CPB) normotérmica (36-37 °C). Todos los componentes de los circuitos fueron recubiertos con superficie inerte de fosforilcolina (PHISIO, Sorin®). El fabricante de la bomba es Maquet® para las bombas de rodillos.1.5 Se tomaron muestras de cm de distalidad de ITA antes de la interrupción del flujo sanguíneo al injerto y antes de iniciar la CEC (Tiempo 1) y otro segmento (1,5 cm) antes de la última anastomosis coronaria durante el pinzamiento aórtico cruzado (Tiempo 2) (Figura 1). Cada segmento arterial se cortó en tres partes: una parte fresca para miografía arterial bañada y almacenada en un baño de órganos de 50 ml que contenía una solución salina fisiológica (PSS). Las otras dos partes se enfriaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para análisis de inmunohistoquímica y RT-PCR.

Prueba de diagnóstico: reactividad vascular de las arterias torácicas internas

1. Análisis de las arterias torácicas internas Miografía Detección de superóxido y microscopía confocal Inmunoquímica Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción en tiempo real (RT-PCR)
2. Muestreo de sangre y análisis bioquímico

OTRO: Grupo bomba centrífuga

La CABG se realizó bajo circulación extracorpórea (CPB) normotérmica (36-37 °C). Todos los componentes de los circuitos fueron recubiertos con superficie inerte de fosforilcolina (PHISIO, Sorin®). El fabricante de la bomba es Sorin® para las bombas centrífugas.1.5 Se tomaron muestras de cm de distalidad de ITA antes de la interrupción del flujo sanguíneo al injerto y antes de iniciar la CEC (Tiempo 1) y otro segmento (1,5 cm) antes de la última anastomosis coronaria durante el pinzamiento aórtico cruzado (Tiempo 2) (Figura 1). Cada segmento arterial se cortó en tres partes: una parte fresca para miografía arterial bañada y almacenada en un baño de órganos de 50 ml que contenía una solución salina fisiológica (PSS). Las otras dos partes se enfriaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para análisis de inmunohistoquímica y RT-PCR.

Prueba de diagnóstico: reactividad vascular de las arterias torácicas internas

1. Análisis de las arterias torácicas internas Miografía Detección de superóxido y microscopía confocal Inmunoquímica Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción en tiempo real (RT-PCR)
2. Muestreo de sangre y análisis bioquímico

Miografía

para cada paciente, se analizaron 2 segmentos frescos de ITA (Tiempo 1 y Tiempo 2) almacenados en PSS. El día +1, estos segmentos se montaron en un miógrafo de alambre (DMT, Aarhens, DK). Se insertaron dos cables de tungsteno (25 μm de diámetro) en el lumen de las arterias y se conectaron a un transductor de fuerza y ​​un micrómetro, respectivamente. Las arterias se bañaron en la solución de PSS. Se aplicó tensión en la pared, equivalente a la presión intraarterial (90 mmHg), y se permitió que los vasos sanguíneos se estabilizaran durante treinta minutos. La contractilidad arterial se evaluó con fenilefrina (PE, 10 μmol/L). Luego se obtuvo la relajación inducida por acetilcolina (Ach 10 μmol/L) después de la preconstrucción inducida por fenilefrina (50% de la contracción máxima) en presencia o ausencia del bloqueador de la síntesis de NO L-NMMA (3.10-4 mol/L) y en presencia o ausencia del bloqueador de la síntesis de COX Indometacina (10-5 mol/L).

Detección de superóxido y microscopía confocal

: se usó tinción con dihidroetidio (DHE, Sigma-Aldrich) para evaluar los niveles in situ de aniones superóxido (O2-). DHE es permeable a las células y se oxida por superóxido (O2-) a productos fluorescentes que quedan atrapados por intercalación en el ADN. Las secciones (10 μm de espesor) se incubaron con DHE (1 μmol/L) en solución tamponada con fosfato (PBS) y DAPI (4',6'-diamidino-2-phénulindole-Molecular probes, Invitrogen) para células nucleares Imágenes fluorescentes de bromuro de etidio se obtuvieron utilizando un microscopio confocal (Nikon Eclipse TE2000S).

Inmunoquímica

secciones (10 μm de espesor) de arterias se rehidrataron con 500 μl de PBS durante 10 minutos y se fijaron con 200 μl de paraformaldehído (PFA) (pH = 7,4, temperatura ambiente) y luego se enjuagaron con PBS. Se procedió a la permeabilización con 200 μl de PBS-BSA (Albúmina de Suero Bovino - Sigma) al 10% - Tween al 0,1% durante 40 minutos y luego a la saturación con PBS-BSA al 10% durante 40 minutos. Las secciones se incubaron durante la noche con 100 μl de anticuerpo anti-CD45 a una dilución de 1/500 para la tinción de leucocitos o anticuerpo anti-CD80 a una dilución de 1/200 para la tinción de linfocitos. Los anticuerpos se marcaron con un fluorocromo rojo (Ficoeritrina). El carioplasma se tiñó de azul con solución DAPI. El día +1, las secciones se enjuagaron con PBS y se analizaron con el microscopio confocal. Las imágenes fluorescentes se cuantificaron con el software ImageJ (NIH).

Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción en tiempo real (RT-PCR)

Las secciones de ITA se secaron y almacenaron a -80 ° C en reactivo de estabilización posterior de ARN (Qiagen). La extracción de ARN se realizó utilizando el microkit RNeasy® (Qiagen). Se usaron 500 ng de ARN extraídos de cada arteria para sintetizar ADNc usando el kit de transcripción inversa QuantiTect® (Qiagen). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con Sybr® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) utilizando un sistema de PCR en tiempo real Light Cycler 480 (Roche).

Muestreo de sangre y análisis bioquímico

Se recogieron muestras seriadas de sangre arterial para elastasa y para SC5b-9, marcador de la activación del complejo terminal del complemento, en el Tiempo 1 y el Tiempo 2. Las muestras se centrifugaron (10 minutos, 3000 rpm, 4 °C) inmediatamente para obtener plasma que se almacenó a - 80°C antes del análisis.

Se utilizaron técnicas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas a partir de 10 μl de plasma para medir el complemento terminal (SC5b-9; Quidel, San Diego, CA, EE. UU.) y 50 μl de plasma para elastasa de neutrófilos (Neutrophil ELA2, Assay pro, St Charles, EE. UU. ). El límite de sensibilidad de cada ensayo realizado fue el siguiente: SC5b-9 = 16 ng/mL y elastasa = 20 ng/mL.