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Le potentiel ostéogénique de la membrane shneiderienne du sinus maxillaire humain (HMSSM)

8 février 2016 mis à jour par: BERBERI ANTOINE

Phase 1 : Étude du potentiel ostéogénique de la membrane shneiderienne du sinus maxillaire humain

Les objectifs de cette étude sont :

  1. pour tester le potentiel ostéogénique de la membrane schneiderienne du sinus maxillaire humain (hMSSM).
  2. Étudier l'expression du marqueur des cellules souches mésenchymateuses (STRO-1), un marqueur des cellules progénitrices mésenchymateuses à l'aide de la cytométrie en flux, et l'expression du phosphate alcalin, la coloration à l'alizarine rouge et Von Kossa et la PCR quantitative.

Aperçu de l'étude

Statut

Complété

Description détaillée

  1. Isolement et culture de cellules dérivées de hMSM.

    Le tissu sera lavé à nouveau avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant un antibiotique et un antimytosique, coupé en petits morceaux dans des conditions aseptiques, traité avec 0,06 % de collagénase de type II (in vitrogène) et dispase, agité avec un incubateur (incubateur à CO2, Forma Scientific) contenant 5 % de CO2 à 37 °C pendant 4 heures, et centrifugé à 1 000 (révolution par minute) pendant 10 minutes (centrifugeuse de table de grande capacité).

    • Le précipité a été mis en suspension dans un milieu essentiel alpha minimum (α-MEM) (Sigma-Aldrich) contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine et filtré avec un tamis cellulaire de 40 μm (BD Bioscience), avec lequel tous les tissus à l'exception des cellules dérivées du hMSSM, elles ont été filtrées.
    • La solution filtrée a été cultivée dans un incubateur. Les caractéristiques morphologiques quotidiennes seront observées au microscope inversé et la solution de culture sera changée tous les deux jours. Lorsque le milieu sera changé, les cellules non adhérentes à la plaque de culture seront retirées et seules les cellules adhérentes seront cultivées. Lorsque les boîtes de culture deviennent presque confluentes, les cellules seront séparées avec de l'acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et ensuite répétées pour un passage continu. Les cellules seront dosées au passage 3 pour leur potentiel ostéogénique.
  2. Cytométrie en flux. L'analyse par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l'expression de marqueurs de cellules ostéoprogénitrices a été réalisée sur des échantillons de cultures de cellules primaires (P0), de cultures de passage 1 (P1) et de cultures de passage 2 (P2) cultivées dans un milieu non ostéogénique.

    La cytométrie en flux sur les marqueurs de surface cellulaire STRO-1, CD105 et CD146 pour la séparation des cellules progénitrices mésenchymateuses (MPC) des hMSM sera effectuée. Les cellules dérivées de hMSSM au passage 3 seront placées dans un tube à essai (Becton-Dickinson) par 1 x 104 cellules/mL et lavées trois fois avec un tampon de lavage (0,2 % d'albumine de sérum bovin, 0,1 % d'azoture de sodium, 0,5 mmol/L d'EDTA ). Les anticorps de CD146 (BD Bioscience) et CD105 (BD Bioscience) auxquels l'isothiocyanate de fluorescéine et la phycoérythrine ont été collés seront traités pendant 1 heure et lavés avec du tampon de lavage trois fois, et l'origine des cellules souches a été observée par cytométrie en flux (BD bioscience ). Pour STRO-1 (anticorps monoclonal antisouris humain, sous-classe d'immunoglobuline M ; R&D Systems), l'anticorps a été traité pendant 1 heure et lavé trois fois avec un tampon de lavage, et l'anticorps secondaire, auquel l'isothiocyanate de fluorescéine était attaché, a été traité pendant 30 minutes, lavé trois fois avec un tampon de lavage et observé par cytométrie en flux.

  3. Différenciation ostéogénique des hMSM

    Les cellules dérivées de hMSM au passage 3 ont été incubées dans un milieu ostéogénique pendant 1 à 4 semaines dans des plaques à 12 puits à une densité de 105 cellules par puits et divisées en deux groupes. Le groupe témoin a été replaqué dans un milieu normal (α-MEM complet) et le groupe expérimental a été replaqué dans un milieu de différenciation ostéogénique (α-MEM comprenant 0,1 μm dexaméthasone, 10 μm phosphate de glycérol et 50 μm d'acide L-ascorbique 2-phosphate ). Les médias ont été changés tous les 3 jours.

    3.1- Phosphatase alcaline et coloration au rouge d'alizarine. Les cultures témoins et expérimentales ont chacune été lavées trois fois avec de l'eau stérile triplement distillée à 7, 14, 21 et 28 jours après la date de traitement, fixées avec une solution de fixation citrate-acétone-formaldéhyde (Sigma) et lavées à nouveau trois fois avec de l'eau stérile. eau triplement distillée. Ils ont ensuite été colorés avec un mélange de colorants alcalins (nitrite, Fast Red Violet-alkaline, solution alcaline de naphtol ; Sigma), dans l'obscurité pendant 15 minutes à température normale, lavés trois fois avec de l'eau triple distillée stérile, contre-colorés avec de l'hématoxyline (Sigma ), lavé à nouveau trois fois avec de l'eau triple distillée stérile et observé au microscope inversé.

    Coloration au rouge d'alizarine. Les échantillons des groupes témoins et expérimentaux ont chacun été lavés trois fois avec de l'eau stérile triplement distillée à 7, 14, 21 et 28 jours à compter de la date de traitement, fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % (Merck) pendant 15 minutes, colorés tandis que la lumière était isolée pendant 30 minutes avec une solution de rouge d'alizarine à 2 % (Sigma), lavée à nouveau trois fois avec de l'eau triplement distillée stérile, et la coloration sera observée au microscope inversé.

    3.2- Coloration de Von Kossa. Les cultures témoins et expérimentales ont été lavées trois fois avec de l'eau triple distillée stérile, fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (Merck) à température normale pendant 15 minutes et lavées à nouveau trois fois avec de l'eau triple distillée stérile. Ils ont été colorés pendant 30 minutes tandis que la lumière était isolée avec une solution de nitrate d'argent à 1 % (Merck), lavée trois fois avec de l'eau triple distillée stérile, laissée sous lumière ultraviolette pendant 1 heure, contre-colorée avec de l'éosine à 0,1 % (Sigma), et la coloration sera observé au microscope inversé.

    3.3- PCR quantitative (qPCR). Pour observer l'expression de l'ostéocalcine, les cellules dérivées de hMSM, différenciées en deux groupes, ont été lavées avec (PBS) à 7, 14, 21 et 28 jours après traitement dans un milieu de différenciation ostéogénique et collectées avec un grattoir cellulaire. Une fois que l'acide ribonucléique (ARN) a été séparé avec un kit d'extraction d'ARN, il a subi une réaction de transcription inverse avec l'ARN séparé, l'ostéocalcine ou la sialoprotéine osseuse, ou les amorces et sondes de la protéine de la matrice dentinaire 1, et le prémélange de réaction en chaîne par polymérase de transcriptase inverse (Biosystèmes appliqués). Les données obtenues seront normalisées à l'aide de 18 Shake. Les produits amplifiés ont été analysés à l'aide de l'analyse par tomodensitométrie deal-delta.

  4. Coloration histochimique de l'activité de la phosphatase alcaline dans des coupes congelées de muqueuse sinusienne.

    La muqueuse des sinus fraîchement préparée a été lavée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), coupée en morceaux d'environ 5 x 5 mm, incorporée dans un composé tissulaire à température de coupe optimale (composé OCT ; Miles Laboratories, États-Unis) et stockée à - 80 C. Sections congelées (7 mm) montés sur des lames revêtues de poly-D-lysine ont été fixés avec de l'acétone glacée pendant 1 min et laissés sécher à l'air. Les lames ont été lavées avec du PBS puis incubées avec la solution de substrat pour l'activité phosphatase alcaline contenant 4 mg de phosphate de naphtol dans 0,15 ml de N, N0 -diméthyl-formamide et 12 mg de sel de bleu rapide (Sigma, St Louis, USA) dans 15 ml de tris-chlorure d'hydrogène (pH 9,6). Après rinçage à l'eau distillée, les lames ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline-éosine, noyées dans de la résine soluble dans l'eau et photographiées.

  5. Détermination immunohistochimique de cellules positives pour STRO-1 dans des coupes congelées de muqueuse.

Les coupes congelées (7 mm) ont été fixées avec de l'acétone froide pendant 1 min et lavées dans du PBS. Les lames ont été placées dans du PBS contenant 0,3 % de peroxyde d'hydrogène pendant 15 minutes pour désactiver la peroxydase endogène, lavées et bloquées avec de l'albumine de sérum bovin à 2 % dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Les coupes ont été incubées avec une dilution 1 : 50 de l'anticorps STRO-1 (anticorps monoclonal de souris, sous-classe IgM ; Developmental Studies Hybridoma Bank, Université de l'Iowa, États-Unis) dans une solution de blocage pendant une nuit à 41 °C. Pour la détection de STRO-1- cellules positives, les lames ont été incubées avec une immunoglobuline M anti-souris de chèvre biotinylée (IgM) (1 : 100, An der Grub, Vienne, Autriche) et un conjugué streptavidine-peroxydase (BioFX Laboratories, Inc., MD, USA) chacun à température ambiante pendant 45 min. Le complexe contenant de la peroxydase a été visualisé par un substrat de diaminobenzidine (Dako, Glostrup, Danemark) et contre-coloré avec de l'hématoxyline. Les sections ont été noyées dans de la résine soluble dans l'eau et photographiées.

Type d'étude

Observationnel

Inscription (Réel)

10

Contacts et emplacements

Cette section fournit les coordonnées de ceux qui mènent l'étude et des informations sur le lieu où cette étude est menée.

Lieux d'étude

      • Beirut, Liban, 5208/116
        • PRASE

Critères de participation

Les chercheurs recherchent des personnes qui correspondent à une certaine description, appelée critères d'éligibilité. Certains exemples de ces critères sont l'état de santé général d'une personne ou des traitements antérieurs.

Critère d'éligibilité

Âges éligibles pour étudier

18 ans à 50 ans (Adulte)

Accepte les volontaires sains

Non

Sexes éligibles pour l'étude

Tout

Méthode d'échantillonnage

Échantillon de probabilité

Population étudiée

La présente étude vise à déterminer si la membrane shneiderienne du sinus humain (hMSSM) contient une population de cellules progénitrices ostéogéniques capables de former de l'os en utilisant des tests in vitro.

La description

Critère d'intégration:

  • Patients, (n = 10), ayant souffert d'un excès maxillaire postérieur ou total subissant une impaction supérieure postérieure ou totale maxillaire pour chirurgie orthognathique. Ces patients ne présentent aucun problème pathologique au niveau du sinus maxillaire
  • Patients, (n = 10), qui souffraient d'un problème de sinus et avaient besoin d'un abord nasal chirurgical. Ces patients ont un processus inflammatoire ou une maladie en cours dans le sinus maxillaire

Critère d'exclusion:

  • Les fumeurs ou les patients souffrant de troubles squelettiques et de maladies syndromatiques seront exclus.

Plan d'étude

Cette section fournit des détails sur le plan d'étude, y compris la façon dont l'étude est conçue et ce que l'étude mesure.

Comment l'étude est-elle conçue ?

Cohortes et interventions

Groupe / Cohorte
GROUPE 1
Dix échantillons de membrane sinusienne ont été prélevés sur quinze patients lors d'une approche nasale chirurgicale pour le traitement d'une rhinosinusite chronique.

Que mesure l'étude ?

Principaux critères de jugement

Mesure des résultats
Description de la mesure
Délai
Isolement et culture de cellules dérivées de hMSM - Cytométrie en flux
Délai: 3 mois

Le tissu sera lavé à nouveau avec du PBS contenant un antibiotique et un antimycotique, coupé en petits morceaux dans des conditions aseptiques, traité avec 0,06 % de collagénase de type II et Dispase, agité avec un incubateur contenant 5 % de CO2 à 37 °C pendant 4 heures, et centrifugé. à 1 000 tr/min pendant 10 minutes

  • Le précipité a été mis en suspension dans un milieu essentiel alpha minimum contenant 10% de sérum bovin fœtal (Hyclone) et 1% de pénicilline-streptomycine et filtré avec un tamis cellulaire de 40 μm, avec lequel tous les tissus à l'exception des cellules dérivées de hMSM ont été filtrés.
  • La solution filtrée a été cultivée dans un incubateur. Les caractéristiques morphologiques quotidiennes seront observées au microscope inversé et la solution de culture sera changée tous les deux jours. Lorsque le milieu sera changé, les cellules non adhérentes à la plaque de culture
3 mois

Collaborateurs et enquêteurs

C'est ici que vous trouverez les personnes et les organisations impliquées dans cette étude.

Parrainer

Collaborateurs

Les enquêteurs

  • Chercheur principal: Antoine N BERBERI, Ph.D, DENTAL SCHOOL LEBANESE UNIVERSITY

Publications et liens utiles

La personne responsable de la saisie des informations sur l'étude fournit volontairement ces publications. Il peut s'agir de tout ce qui concerne l'étude.

Dates d'enregistrement des études

Ces dates suivent la progression des dossiers d'étude et des soumissions de résultats sommaires à ClinicalTrials.gov. Les dossiers d'étude et les résultats rapportés sont examinés par la Bibliothèque nationale de médecine (NLM) pour s'assurer qu'ils répondent à des normes de contrôle de qualité spécifiques avant d'être publiés sur le site Web public.

Dates principales de l'étude

Début de l'étude

1 mars 2014

Achèvement primaire (Réel)

1 septembre 2015

Achèvement de l'étude (Réel)

1 septembre 2015

Dates d'inscription aux études

Première soumission

6 septembre 2015

Première soumission répondant aux critères de contrôle qualité

8 février 2016

Première publication (Estimation)

9 février 2016

Mises à jour des dossiers d'étude

Dernière mise à jour publiée (Estimation)

9 février 2016

Dernière mise à jour soumise répondant aux critères de contrôle qualité

8 février 2016

Dernière vérification

1 février 2016

Plus d'information

Termes liés à cette étude

Termes MeSH pertinents supplémentaires

Autres numéros d'identification d'étude

  • 18840

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