A keringő daganatos plazma DNS mikroarray CGH elemzése MPNST-ben szenvedő NF1-es betegekben

Bevezetés Az 1-es típusú neurofibromatosis (NF1) egy autoszomális domináns rendellenesség, amely 3500 élő újszülöttből 1-nél fordul elő. A betegséget a 17q11.2 kromoszómán található NF1 gén heterozigóta mutációi okozzák. Az NF1 gén a tumorszuppresszor neurofibromint kódolja, amely a RAS onkogén negatív szabályozója. Klinikailag az NF1-es betegek café-au-lait makulát, szeplőt, Lisch-csomókat és neurofibromákat mutatnak. Ezeknél a betegeknél gyakoriak a kognitív problémák, a csontsérülések és a látóideg-gliomák is.

A neurofibrómák a perifériás ideghüvely jóindulatú daganatai, amelyek az NF1-betegek testében bárhol megjelenhetnek. A neurofibromák különböző sejttípusokból állnak, mint például Schwann-sejtek, fibroblasztok, hízósejtek és perineuriális sejtek. Ha az NF1-es betegek Schwann-sejtjeiben a vad típusú NF1 allél inaktiválódik, neurofibroma képződik. A neurofibromák 3 típusa létezik: bőr, szubkután és plexiform. A bőr neurofibromák serdülőkorban izolált csomókként jelennek meg a bőrben, illetve a bőr alatt. A plexi alakú neurofibromák veleszületettek, és a perifériás ideg nagy szegmensén terjedhetnek. A szubkután neurofibromák a perifériás idegeken elhelyezkedő, különálló csomók, keletkezésük időpontja nem ismert, de valószínűleg prenatális eredetűek is.

Minden NF1-es beteg élete során 8-13% a kockázata a rosszindulatú perifériás ideghüvely daganat (MPNST) kialakulásának. Ez a kockázat még kétszer akkora, ha az NF1-betegek egy alpopulációja, nevezetesen az NF1-mikrodeléciós betegek egy része. Az MPNST-ket nehéz diagnosztizálni a korai fázisban, mivel ezeknél a betegeknél gyakran előfordulnak nagyszámú daganat és sokféle hely. Ezek a daganatok könnyen beszivárognak a környező szövetekbe, és gyakran metasztázisokat okoznak. Jelenleg az egyetlen elérhető kezelés ezen MPNST-k műtéti eltávolítása. A teljes reszekció gyakran nehézkes a daganatok mérete és a fontos idegeken való elhelyezkedés miatt, valamint az a tény, hogy a daganatok gyakran már a diagnóziskor metasztázisban vannak. Az MPNST-ben szenvedő betegek ötéves túlélése kevesebb, mint 25%. Az MPNST-k esetében, más rákokhoz hasonlóan, a betegség kiterjedése és terjedése a diagnózis időpontjában fontos tényező a kezelés kimenetelének meghatározásában. Ebben a tekintetben daganatmarkereket fejlesztettek ki a daganatok szűrésére, de a rákos megbetegedések csak egy részcsoportja választ ki markerként használható specifikus fehérjéket. Egyre nőtt az érdeklődés az új markerek, például a keringő nukleinsavak iránt. A sejtmentesen keringő nukleinsavak kimutatása egészséges és beteg egyének plazmájában, szérumában és egyéb testnedveiben lehetőséget teremtett a betegség diagnosztizálására és monitorozására, ami az MPNST-ben szenvedő NF1-es betegeknél is alkalmazható lehet. Az extracellulárisan keringő nukleinsavak jelenlétét egészséges és beteg emberek vérében először Mandel és Métais írta le 1948-ban. 1977-ben a Leon csoport volt az első, amely számszerűsítette a sejtmentes DNS-t a szérumban. Azt találták, hogy a rákos betegeknél magasabb volt a keringő DNS szintje, mint az egészséges kontroll egyénekben, és a DNS mennyisége még nagyobb volt az áttétekkel rendelkező betegeknél, mint a lokalizált betegségben, de semmit sem tudtak a DNS eredetéről. Jelentős előrelépés történt a plazma/szérum DNS-kutatásban, amikor daganatos mikroszatellit elváltozások jelenlétét jelentettek daganatos betegek plazmájában és szérumában. Ezen eredmények szerint azt sugallják, hogy a keringő DNS potenciálisan alkalmas a rosszindulatú daganatok diagnosztizálására és prognózisára. Ennek ellenére a DNS felszabadulásának mechanizmusa nem teljesen tisztázott, és különböző hipotéziseket javasoltak. Az első hipotézis, miszerint a keringő DNS a tumorsejtek nekrózisa vagy apoptózisa miatti DNS-szivárgásból származik, ellentmondásossá vált, amikor arról számoltak be, hogy a DNS-szint csökkent a sugárterápia után. Egy másik, mikrometasztázisokkal kapcsolatos hipotézist is elvetettek, mert a plazmában lévő sejtek száma nem egyezik a keringő DNS mennyiségével. A harmadik hipotézis a tumoros DNS spontán és aktív felszabadulása a vérben a szaporodó sejtek által. Ez utóbbi mechanizmusra azonban nincs meggyőző magyarázat.

Kutatási protokoll A tanulmány első része a plazmából történő DNS-kivonás technikájának optimalizálása lesz. Prof. Dr. Patrick Schöffski (UZLeuven) együttműködésével gyűjtött mintákon különböző, az irodalomban leírt DNS-kivonási módszereket tesztelünk. Amikor vért vesznek a rákos betegektől rutinvizsgálat céljából, további 5 ml (EDTA-csőben) áll majd rendelkezésre kísérleteinkhez. A mintavételt követő néhány órán belül vérmintákat veszünk, és 24 órán belül feldolgozzuk laboratóriumunkban (a neurofibromatózis-kutatás laboratóriumában). A vérmintákat 1600 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 10 percig. A felülúszó plazmát a buffy coat megzavarása nélkül összegyűjtjük, és 13 000 fordulat/perc sebességgel újra centrifugáljuk 10 percig, hogy eltávolítsuk a részecskéket. A felülúszó plazmát 0,5 ml-es aliquot részekre osztjuk. A mintákat -80°C-on tároljuk a további felhasználásig. A szakirodalom szerint páciensenként különböző alikvotokat különböző módszerekkel, például fenol-kloroformos extrakcióval és kereskedelmi készletekkel vonnak ki. A genomi referencia-DNS-t a buffy coat-ból fenol-kloroformos extrakcióval extraháljuk. A DNS-kivonás típusától függően a DNS mennyiségében és minőségében különbségekre számítunk. MPNST-ben szenvedő NF1-betegek plazmájából történő DNS-kinyeréshez a legmagasabb hozamú és legjobb DNS-minőségű módszert választják.

A munka második része a microarray kísérlet optimalizálása lesz plazma DNS felhasználásával. Az MPNST-ben szenvedő NF1-betegek plazmamintáját a németországi Eppendorf Egyetem munkatársával, Victor Mautnerrel együttműködve gyűjtik. A vérminták közvetlen feldolgozását Németországban végzik majd, és a fagyasztott buffy coat-okat és plazma alikvotokat kódolt módon küldik Leuvenbe. A buffy coatokkal és a plazmával együtt a betegek MPNST fagyasztott szövetét is küldik. A tumor DNS-ét fenol-kloroformos extrakcióval vonják ki. Microarray CGH-t végeznek mind a tumoron, mind a plazma DNS-en buffy coat DNS-sel, hogy kizárják a kópiaszámú változó régiókat a kópiaszám-változások listájából. A plazma DNS tömbprofiljait ellenőrizni fogják a tumorral kapcsolatos kópiaszám-változások szempontjából. Ily módon az array protokoll tovább optimalizálható a plazmából származó sejtmentes DNS tumorspecifikus kópiaszám-rendellenességeinek kimutatása érdekében.

Ezt a tanulmányt Eline Beert, a neurofibromatózis-kutatási laboratórium PhD-hallgatója és Radost Ratcheva, a neurofibromatózis-kutatási laboratórium mesterszakos hallgatója végezte a „orvosbiológiai tudományok doktora” és a „orvosbiológiai mester” fokozat megszerzésének részeként. Tudományok, illetve Prof. Dr. Eric Legius, mint kezdeményező és fő kutató. Csak a Katholieke Universiteit Leuven és az UZ Leuven, de kereskedelmi partnerek (például cégek) nem vesznek részt ebben a tanulmányban. A leírt kísérletek eredményeit tisztán tudományos információnak kell tekinteni, és ezekről nem számolnak be a betegeknek.

Az UZLeuven rákbetegek vérmintáit csak a DNS-kivonási eljárás optimalizálására használjuk fel, a kinyert DNS-t mennyiségileg meghatározzák, de nem vizsgálják tovább, majd megsemmisítik.