Studio sull'eziologia della malattia di Kawasaki

Selezione dei pazienti e sorveglianza familiare: presso il National Taiwan University Hospital di Taiwan, studieremo i pazienti che soddisfano i criteri della malattia di Kawasaki o della malattia di Kawasaki atipica e i loro familiari dal 2004 al dicembre 2005. Si otterrà l'approvazione del Comitato di revisione istituzionale per questo studio e si otterranno consensi informati da tutti i soggetti o dai loro genitori. Se i pazienti del servizio di emergenza, della clinica ambulatoriale o del reparto di degenza presentavano sindromi cliniche suggestive di infezione da EV71, a loro e ai loro familiari veniva chiesto di partecipare allo studio. Tamponi faringei e rettali per l'isolamento del virus e il primo prelievo di sangue. Sono state registrate le manifestazioni cliniche, i decorsi e gli esiti. Se in qualsiasi momento i pazienti sospettati di infezione mostravano sintomi clinici, agli altri membri della famiglia nella stessa famiglia veniva chiesto di sottoporsi a screening mediante isolamento del virus dei tamponi faringei e ricevevano il primo campione di sangue. Sono state utilizzate interviste basate su questionari per raccogliere informazioni tra cui dati demografici, numero di camere da letto nella famiglia, tempo di contatto, modello e presenza di segni e sintomi attuali/recenti (tosse, rinorrea, mal di gola, eruzione cutanea, febbre, dolore addominale e diarrea ) e precedente storia di contatti con persone extra-familiari che presentavano patologie cliniche. Interviste telefoniche di follow-up ripetute domande su segni e sintomi a intervalli di 2, 4 e 8 settimane. Se un membro della famiglia ha riferito di aver manifestato segni o sintomi indicativi della malattia di Kawasaki durante il periodo di follow-up, il membro della famiglia riceverà un'ulteriore valutazione clinica e ripetute indagini di laboratorio per la malattia di Kawasaki. Un secondo campione di sangue è stato prelevato dai casi di KD e da tutti i membri della loro famiglia 4 settimane dopo il prelievo del primo campione di sangue. Selezione del caso di controllo: verrà selezionato casualmente un controllo corrispondente per età e sesso. Il controllo saranno i pazienti ricoverati nello stesso reparto che hanno altre diagnosi (come polmonite, UTI, tonsillite). Riceveranno anche lo schermo per l'analisi di virus e batteri come fanno i membri della famiglia.

Definizioni della malattia di Kawasaki e della malattia di Kawasaki atipica:

1. Criteri per la malattia di Kawasaki:

   • uguale o superiore a cinque dei seguenti: febbre per più di 5 giorni, congiuntivite non purulenta, rash cutaneo, indurimento palmo/pianta del piede ed eritema seguito da desquamazione, linfoadenopatia del collo, lingua a fragola o ragadi/sanguinamento delle labbra
2. malattia di Kawasaki atipica; meno di cinque dei precedenti ma con aneurisma coronarico.

Metodi di laboratorio

1. Isolamento del virus e sierotipizzazione:

   Tamponi faringei, tamponi rettali o campioni di feci sono stati inviati per l'isolamento del virus. I campioni sono stati inoculati in colture cellulari di fibroblasti embrionali umani, LLC-MK2, HEp-2 e rabdomiosarcoma (RD). Quando l'effetto citopatico ha coinvolto più del 50% del monostrato cellulare, le cellule sono state raschiate e sottoposte a colorazione anticorpale fluorescente indiretta con anticorpi specifici (Chemicon International Inc., Temecula, CA) o tipizzate con metodi specifici in base ai sospetti tipi di virus.

2. Diagnosi molecolare per virus o altri patogeni difficili da coltivare:

   1. Estrazione dell'RNA e dell'RNA virale: L'estrazione dell'RNA e del DNA verrà eseguita utilizzando il kit di isolamento secondo la guida del produttore. (Kit di estrazione dell'RNA, Qiagen). 140 uL di tampone faringeo sono stati miscelati con tampone AVL per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, fai girare la miscela. Aggiungere 560 uL di alcool al 100% nel pellet e incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. La miscela sarà messa nella colonnina e centrifugata a 8000 rpm per 1 minuto due volte. Quindi, verranno aggiunti 500uL di tampone AW1 e la miscela sarà centrifugata a 80000 rpm per 1 minuto, quindi verranno aggiunti 500uL di tampone AW2 e centrifugati a 14000 rpm per 3 minuti. Eliminare la soluzione e centrifugare a 14000 rpm per 2 minuti. Infine, verranno aggiunti da 25 a 30 uL di tampone AVE e centrifugati a 8000-10000 rpm per 1 minuto.
   2. Trascrizione inversa: la RT sarà eseguita con il 1st strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (Roche). Miscelare l'RNA precedentemente estratto con i reagenti inclusi tampone, MgCl2, dNTP, primer Oligo-p(dT)15, inibitore dell'RNasi, trascrittasi inversa, agitare brevemente su vortex, incubare la reazione a 25°C per 10 minuti e quindi a 42°C per 60 minuti. Infine incubare a 99°C per 5 minuti e poi raffreddare a 4°C per 5 minuti.
   3. PCR TagMan in tempo reale per enterovirus, adenovirus o altra eziologia virale. I primer e le sonde per la PCR in tempo reale di enterovirus e altri virus sono riportati nella tabella seguente. I primer e le sonde per PanEV sono stati selezionati sulla base di regioni altamente conservate nella regione 5' non tradotta del genoma dell'enterovirus. I primer e le sonde per EV71 sono stati selezionati in base alle regioni genetiche più diverse e specifiche nella regione VP1 del genoma dell'enterovirus. Altri potenziali virus, come l'adenovirus, o altri virus respiratori saranno eseguiti anche mediante PCR o RT-PCR o PCR in tempo reale seguendo le regole delle procedure di cui sopra.
   4. Analisi differenziale rappresentazionale seguita da clonazione sottrattiva
3. Colture batteriche e rilevamento delle tossine: le colture sono state ottenute dalla faringe e dal retto di pazienti con KD acuta prima dell'inizio dell'infusione endovenosa di immunoglobuline e da pazienti di controllo con l'uso di un sistema Baxter Diagnostics Culturette che contiene un batuffolo di cotone. Il foglio di raccolta dei dati primari è stato completato e conservato presso il sito in cui sono stati ottenuti i campioni. Le piastre sono state quindi esaminate per tutti gli streptococchi α-emolitici di gruppo A e per tutti gli S aureus che erano coagulasi positivi mediante il test in provetta. Questi isolati sono stati quindi sottoposti a screening in cieco per la presenza di produzione di superantigeni batterici mediante immunodiffusione con antisieri contro noti superantigeni stafilococcici e streptococcici come descritto in precedenza. (Lee PK e Schlieveret PM).
4. Test sierologici: i test sierologici per il rilevamento degli anticorpi di Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO saranno misurati mediante kit commerciali. L'anticorpo neutralizzante per l'enterovirus sarà eseguito secondo il protocollo standard del test di neutralizzazione su piastre di microtitolazione. L'isolato EV71 TW/2272/98 è stato amplificato e purificato come antigene per ELISA m-capture per il rilevamento di IgM EV71. Se viene definito un potenziale agente patogeno, in seguito verranno eseguiti ulteriori test sierologici per l'agente patogeno specifico.
5. Analisi statistica: i dati sono stati analizzati con il pacchetto statistico SAS (versione 8.2, SAS Institute, Cary, North Carolina). Abbiamo utilizzato il test t di Student per le variabili continue e il test c 2 per i dati categorici. Dopo che l'analisi univariata ha vagliato le variabili statisticamente significative, è stata eseguita un'analisi di regressione logistica multipla graduale in avanti per regolare simultaneamente i confondenti e per calcolare gli odds ratio aggiustati multivariati. Il livello di selezione del modello è stato fissato a 0,15 per i modelli in-and-out. P <.05 è stato considerato statisticamente significativo.