TMおよびTI患者の骨粗鬆症を治療するためのネリドロネート（Nerixia®）の有効性と安全性 (Nerixia)

研究の目的 現在、世界的な治療アプローチにより、サラセミアメジャーおよび重症サラセミアインターメディアの予後は決まっていません。 小児期からの定期的な輸血レジメンと初期の鉄キレート療法は、過去にこの疾患の特徴であった骨の変形を防ぎます。 この持続的な合併症は、貧血、遺伝的要因、骨代謝に関与する性ホルモン、鉄およびキレート療法、甲状腺機能低下症、血清ビタミンDの低濃度または正常以下の濃度など、1つまたは複数の共存する要因によって説明される場合があります.

痛みは、ジェノバのセンターで実施された生活の質に関する調査を通じて、サラセミア メジャーの患者を同年齢の健康な患者と区別するために考慮できる唯一のパラメーターであるという結果になりました。 多くの場合、痛みは腰椎に局在し、無効な写真で説明されることが多く、椎体の骨粗鬆症に言及する必要があります。

これらの病状を治療する専門センターで観察される自然骨折の発生率は増加しています。

サラセミア中間体は、軽度から重度の形態まで幅広い表現型を含む不均一な臨床実体です。 軽度の場合、ヘモグロビンレベルは 8 ～ 9 g/dl の範囲であり、併発性エピソードによって貧血が悪化しない限り、定期的な輸血療法を必要とせずに安定しています。骨髄の拡張は観察されません。 対照的に、貧血が持続的により重篤であり（6.5～7.5 g/dl）、著しく効果のない赤血球生成を伴う形態があります。 これらの場合、特に小児期に診断が下された場合、患者は、骨粗鬆症などの同様の合併症を伴う主要な形態と同様の輸血療法を受ける必要があります。

これらの理由から、重度サラセミア中間体およびサラセミアに冒された患者において、生活の質と平均余命の両方を改善するために、確立された疾患の治療と同様に、骨粗鬆症の大予防と早期診断が重要です。

前述の治療試験では、ビスフォスフォネートは骨吸収を阻害する能力があり、骨密度の増加をもたらす副作用が比較的少ないため、有効であることが示されています。 以前のすべての試験は少数の患者で実施されたため、ネリドロネートの有効性をテストするために無作為化された非盲検の大規模多施設試験を提案します。 この薬を90日ごとに静脈内投与できるため、投薬計画が簡単になり、投与頻度が減少します。 これらは、すでに毎日の治療負荷が高い患者の治療遵守を改善するための重要な要素です。

主な目的 この研究の主な目的は、測定された骨密度 (BMD) を増加させるネリドロネート (いくつかの臨床試験で破骨細胞を介した骨吸収を阻害する能力があることが証明されている第 3 世代のアミノビスホスホネート) の有効性を評価することです。二重X線デンシトメトリー（DXA）による。 骨密度測定は、基礎スクリーニングで行われ、治療開始から 6、12、18、24 か月後に行われます。

副次的な目的 骨代謝回転に対するネリドロネートの効果は、骨アルカリホスファターゼ (BALP) および 1 型血清コラーゲンのテロペプチド C 末端 (CTX-s) を介して、スクリーニング時およびその後 6、12、18、24 か月で評価されます。治療の始まり。

マーカーの投与量は一元化されます。 研究デザイン サラセミアメジャーおよび重度サラセミア中間体の患者における骨粗鬆症の治療におけるネリドロネートの有効性と安全性を評価する、イタリアの多中心無作為化非盲検治療試験。

薬の有効性と安全性は、訪問ごとに次のパラメーターを測定して評価されます。

• 血液学: ヘモクローム
• 血液化学：クレアチニン、BUN、AST、ALT、Ca、P、タンパク質電気泳動、総タンパク質。

異所性石灰化および弾性黄色腫（PXE）様症候群の有病率とそれらのフォローアップは、身体検査、腹部超音波検査、および眼底検査を通じて、研究の開始時と24か月間で評価されます。

試験中、骨折の有病率と発生率を含む、骨粗鬆症の他の既知の危険因子が記録され、実行された場合は、多形症 COLIA1 研究の開始時および12か月目と24か​​月目に、骨変形の存在を評価するための形態計測DXAさらに、スケールSF-36の投与により、QOLと症状の痛みに関するデータが評価されます。

試験中、すべての有害事象が記録されます

延長調査:

普及調査の目的

1. 間葉系幹細胞の増殖と骨形成分化に対する鉄過剰とキレート分子の影響の in vitro 解析
2. 正常およびサラセミア MSC の増殖と分化に対するネリドロネートの効果の評価。
3. ネリドロネートの有無にかかわらず治療されたサラセミア患者から調製された MSC の表現型の特徴付け 研究デザイン A. MSC の増殖および骨形成分化に対する鉄過剰およびキレート分子の影響の in vitro 解析 B. 正常およびサラセミア MSC の増殖に対するネリドロネートの影響の評価そして差別化。

C. ネリドロネートの有無にかかわらず治療されたサラセミア患者から調製された MSC の表現型の特徴付け

1. 正常な被験者からの骨髄間葉系幹細胞のコレクションの準備 MSC を分離して準備するには、Oliva et. アル。 (モレック。 そしてセル。 Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，２４７：５５－６０）。 MSC の準備の詳細は、付録で報告されています。

   細胞は、CD13、CD29、CD44、CD105、CD166 などの特定の表面マーカーを発現し、造血細胞マーカー CD14、CD34、および CD45 に対して陰性でした。

   このようにして、実験を行う通常の MSC バンクを準備しています。 現在、健常者からのMSCの調製物はすでに10種類以上あります。

2. MSC の増殖と分化に対する鉄過剰の影響の分析 サラセミア患者が鉄過剰になることはよく知られていますが、この金属が MSC の増殖と分化に及ぼす影響に関する文献にはデータがありません。 この目的のために、以下に示すように進めます。 対数増殖期の MSC の増殖速度と鉄およびフェリチンの細胞内レベルを評価します。鉄の濃度を増加させながら培養し、生理的血中量、つまり 2 ～ 18 μg/ml から開始して、発生したものと同様の 10 倍高い値に達するまで評価します。サラセミア患者で。 細胞の直接計数、MTT 活力アッセイ、および 3H-チミジンの取り込み (DNA 合成) によって、増殖率への影響を分析します。

   続いて、報告されたプロトコルに従って、MSC の主要なタンパク質産物である I 型コラーゲンのレベルに対する鉄の過負荷の影響を分析します。 非処理および鉄過負荷で処理した MSC の初期継代 (0 ～ 3) のコンフルエントな培養物をトリプシン処理し、計数し、800xg で遠心分離します。 ペレットは、250 μg/ml ペプシンを含む 0.5 M 酢酸に再懸濁されます。

   4°Cで16時間穏やかに振盪した後、不溶性残留物を20.000xgで1時間ペレット化し、実行バッファーに可溶化し、6% SDS-PAGEで分析します。 その後、タンパク質をニトロセルロース膜にブロットし、ヒト I 型コラーゲンに特異的なウサギモノクローナル抗体とともにインキュベートします。 次いで、免疫反応性バンドを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートし、増強化学発光技術(ECL)によって検出する。

   分化に対する効果は、骨芽細胞表現型の特異的マーカー、すなわちアルカリホスファターゼ活性およびオステオカルシン産生の発現を分析して評価される。 さらに、細胞外マトリックスの石灰化によって発現される MSC の骨形成能力を評価します。 コンフルエントな培養物を、デキサメタゾン 100 nM およびベータ-グリセロホスフェート 10 mM から構成される骨形成培地でインキュベートします。 骨形成能が存在する場合、石灰化結節が 2 ～ 4 週間以内に現れます。 マトリックスの石灰化をさらに確認するために、カルシウム レベルを測定し、最後にフォン コッサ法による特定の染色を行います。

3. MSC の増殖と分化に対する鉄キレート分子の効果の分析 DFO の効果を評価します。DFO は、よく知られている欠点と毒性にもかかわらず、サラセミアの治療でこれまで最も使用されているキレート分子です。 サラセミア患者への薬物投与後にインビボで得られる濃度と同様の濃度で、未処理または鉄過負荷で処理されたMSC培養物にDFOを添加する。 成長率、I 型コラーゲン レベル、アルカリホスファターゼ活性、オステオカルシン産生、および骨形成能力に対する治療の効果を分析します。
4. 鉄過剰および/またはDFOを受けたMSCにおける細胞周期成分の特徴付け 細胞周期成分の特徴付けが、増殖および分化プロセスの極めて重要な事象を理解するための基礎となることはよく知られています。

したがって、上記のように処理された両方のMSC細胞集団から得られた細胞抽出物（すなわち 鉄、DFOまたは鉄過剰および/またはデスフェリオキサミン)は、いくつかのサイクルタンパク質成分に対する抗体を使用するイムノブロッティングによって分析されます。 それらの中で特に：サイクリンD1、D2、およびD3、サイクリンE、サイクリンA。 CDK4、CDK6、CDK2、CDK1; p16、p14、p15、p21、および p27。 さらに、網膜芽細胞腫タンパク質のリン酸化とcdk活性を分析します。

B.正常およびサラセミアMSCの増殖および分化に対するネリドロネートの効果の評価。

この研究の目的は、正常およびサラセミアのヒト MSC に対するネリドロネートの効果の in vitro 分析です。 特に、10(-4) M と 10(-6) M の間の濃度で試験された薬物が 10(-5) M の治療用量であるかどうかを評価し、MSC の生存率、増殖、および細胞活性に影響を与えます。 増殖への影響は、3H-チミジンの取り込み、MTT テスト、および細胞周期エンジンの調節に関して評価されます。 分化に対する作用は、特定のマーカー、すなわちタイプ I コラーゲン レベル、アルカリホスファターゼ活性、およびオステオカルシン産生の発現を分析して評価されます。 さらに、細胞外マトリックスの石灰化、カルシウムレベルの測定、およびフォンコッサ染色によって発現されるMSCの骨形成能力を評価します。

C. ネリドロネートの有無にかかわらず治療を受けたサラセミア患者から調製された MSC の表現型の特徴付けMSC。 したがって、ネリドロネートで治療された、または治療されていないサラセミア患者からMSCを調製し、標準的な方法に従って培養します。 特に、成長率、細胞周期機構、コラーゲン レベル、AP 活性、オステオカルシン合成を分析します。 最も重要なことは、細胞外マトリックスの石灰化を評価することです。