Werkzaamheid en veiligheid van neridronaat (Nerixia®) voor de behandeling van osteoporose bij patiënten met TM en TI (Nerixia)

Doel van de studie Vanwege de wereldwijde therapeutische benadering is de prognose van Thalassemia Major en Severe Thalassemia Intermedia op dit moment van onbepaalde duur. Regelmatige transfusieregimes vanaf de kindertijd en vroege ijzerchelatietherapie voorkomen botmisvormingen die in het verleden deze ziekte kenmerkten, ook al lijdt volgens verschillende auteurs een hoog percentage van de patiënten aan osteopenie-osteoporose. Deze aanhoudende complicatie kan worden verklaard door een of meer coëxistente factoren zoals bloedarmoede, genetische factoren, geslachtshormonen die betrokken zijn bij het botmetabolisme, ijzer- en chelatietherapie, hypothiroidisme, lage of subnormale concentraties van serum vitamine D, enz.

Pijn bleek de enige parameter die kan worden overwogen om patiënten met Thalassemia Major te onderscheiden van gezonde patiënten van dezelfde leeftijd door middel van een enquête over de kwaliteit van leven die werd uitgevoerd in het centrum van Genua. Pijn is vaker gelokaliseerd in de lumbale wervels, wordt vaak beschreven met ongeldige foto's en moet worden verwezen naar osteoporose van wervellichamen.

De incidentie van spontane fracturen die worden waargenomen in de gespecialiseerde centra die deze pathologieën behandelen, neemt toe.

Thalassemia Intermedia is een heterogene klinische entiteit die een breed scala aan fenotypes omvat, van milde tot ernstige vormen. Bij de milde vormen ligt het hemoglobinegehalte tussen 8-9 g/dl, wat stabiel is zonder de noodzaak van regelmatige transfusietherapie, tenzij een bijkomende episode bloedarmoede verergert; er wordt geen expansie van het beenmerg waargenomen. Daarentegen zijn er vormen waarbij bloedarmoede aanhoudend ernstiger is (6,5-7,5 g/dl) met duidelijke ineffectieve erytropoëse. In deze gevallen, vooral wanneer de diagnose in de kindertijd wordt gesteld, dienen patiënten een transfusieregime te krijgen dat vergelijkbaar is met de ernstige vormen met vergelijkbare complicaties zoals osteoporose.

Om deze redenen zijn bij patiënten met ernstige thalassemie intermedia en thalassemie belangrijke preventie en vroege diagnose van osteoporose belangrijk, evenals behandeling van de vastgestelde ziekte om zowel de kwaliteit van leven als de levensverwachting te verbeteren.

In therapeutische onderzoeken is aangetoond dat eerder beschreven bisfosfonaten effectief zijn vanwege hun vermogen om botresorptie te remmen en hun relatief weinig bijwerkingen die resulteren in een toename van de botdichtheid. Aangezien alle eerdere studies werden uitgevoerd op een klein aantal patiënten, stellen we een gerandomiseerde, open-label grote multicentrische studie voor om de werkzaamheid van neridronaat te testen. De mogelijkheid om dit medicijn om de 90 dagen intraveneus toe te dienen, maakt doseringsregimes eenvoudig en vermindert de toedieningsfrequentie. Dit zijn belangrijke factoren om therapietrouw te verbeteren bij patiënten die al een zware dagelijkse therapeutische belasting ondergaan.

Primaire doelstellingen Het primaire doel van deze studie is het evalueren van de werkzaamheid van neridronaat (een aminobisfosfonaat van de derde generatie waarvan in verschillende klinische onderzoeken is bewezen dat het in staat is osteoclast-gemedieerde botresorptie te remmen) om de gemeten botmassadichtheid (BMD) te verhogen. door dubbele röntgendensitometrie (DXA). Botdensitometrie zal worden uitgevoerd bij basale screening en vervolgens op 6, 12, 18, 24 maanden vanaf het begin van de behandeling.

Secundaire doelstellingen Het effect van neridronaat op de botomzetting zal worden geëvalueerd door middel van botalkalische fosfatase (BALP) en telopeptide C-terminal van type 1 serisch collageen (CTX-s), bij screening en vervolgens op 6, 12, 18, 24 maanden na het begin van de behandeling.

De dosering van de markers wordt gecentraliseerd. Onderzoeksopzet Een Italiaans multicentrisch, gerandomiseerd, open-label therapeutisch onderzoek ter evaluatie van de werkzaamheid en veiligheid van neridronaat bij de behandeling van osteoporose bij patiënten met Thalassemia Major en Severe Thalassemia Intermedia.

De werkzaamheid en veiligheid van het medicijn zullen worden geëvalueerd door bij elk bezoek deze parameters te meten:

• hematologisch: hemochroom
• bloedchemie: creatinine, BUN, AST, ALT, Ca, P, eiwitten elektroforese, totale eiwitten.

De prevalentie van ectopische verkalking en pseudoxantoma elasticum (PXE)-achtig syndroom en hun follow-up zullen aan het begin van de studie versus 24 maanden worden geëvalueerd door middel van lichamelijk onderzoek, abdominale echografie en fundus oculi-onderzoek.

Tijdens het onderzoek zullen andere bekende risicofactoren voor osteoporose worden geregistreerd, waaronder de prevalentie en incidentie van botbreuken en, indien uitgevoerd, polimorfismen COLIA1 Aan het begin van het onderzoek en na 12 en 24 maanden morfometrie DXA voor de evaluatie van de aanwezigheid van botmisvormingen Verder zullen gegevens met betrekking tot kwaliteit van leven en symptoompijn worden geëvalueerd door middel van de toediening van schaal SF-36.

Tijdens de proef worden alle bijwerkingen geregistreerd

Verlenging studie:

Doelstellingen van de uitbreidingsstudie

1. In vitro analyse van de effecten van ijzerstapeling en chelerende moleculen op de groei van mesenchymale stamcellen en osteogene differentiatie
2. Evaluatie van de effecten van neridronaat op de proliferatie en differentiatie van normale en thalassemische MSC's.
3. Fenotypische karakterisering van MSC's bereid uit thalassemische patiënten behandeld met of zonder neridronaat Onderzoeksopzet A. In vitro analyse van de effecten van ijzerstapeling en chelerende moleculen op MSC's groei en osteogene differentiatie B. Evaluatie van de effecten van neridronaat op normale en thalassemische MSC's proliferatie en differentiatie.

C. Fenotypische karakterisering van MSC's bereid uit thalassemische patiënten behandeld met of zonder neridronaat A. In vitro analyse van de effecten van ijzerstapeling en chelerende moleculen op MSC's groei en osteogene differentiatie

1. Bereiding van een verzameling mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van normale proefpersonen Om MSC's te isoleren en te bereiden, zullen we het protocol gebruiken dat in detail wordt beschreven in Oliva et. al. (Molek. en Cel. Biochem., 2003, 247:55-60). De details van de voorbereiding van MSC's worden vermeld in de bijlagen.

   De cellen brachten specifieke oppervlaktemarkers tot expressie, zoals CD13, CD29, CD44, CD105, CD166, en waren negatief voor hematopoietische celmarkers CD14, CD34 en CD45.

   Op deze manier bereiden we een normale MSC-bank voor, waarop we de experimenten uitvoeren. Op dit moment hebben we al meer dan 10 bereidingen van MSC's van normale proefpersonen beschikbaar.

2. Analyse van de effecten van ijzerstapeling op proliferatie en differentiatie van MSC's Hoewel het algemeen bekend is dat thalassemische proefpersonen ijzerstapeling ondergaan, zijn er in de literatuur geen gegevens beschikbaar over de effecten van dit metaal op proliferatie en differentiatie van MSC's. Daartoe gaan we te werk zoals hieronder aangegeven. We zullen de proliferatiesnelheid en de intracellulaire niveaus van ijzer en ferritine evalueren in MSC's in logaritmische fase geïncubeerd met toenemende ijzerconcentraties, uitgaande van fysiologische hematische hoeveelheden, d.w.z. 2-18 microg/ml, tot het bereiken van waarden die 10 keer hoger zijn, vergelijkbaar met die welke voorkomen bij thalassemiepatiënten. We zullen het effect op de groeisnelheid analyseren door middel van directe celtelling, MTT-vitaliteitstest en 3H-thymidine-opname (DNA-synthese).

   Achtereenvolgens zullen we de effecten van ijzerstapeling op de niveaus van het belangrijkste eiwitproduct van MSC's, namelijk type I collageen, analyseren volgens het gerapporteerde protocol. Confluente culturen van vroege passages (0-3) van MSC's, onbehandeld en behandeld met ijzerstapeling, worden getripiniseerd, geteld en gecentrifugeerd bij 800xg. De pellets worden opnieuw gesuspendeerd in 0,5 M azijnzuur dat 250 microgram/ml pepsine bevat.

   Na 16 uur zacht schudden bij 4°C wordt het onoplosbare residu gedurende 1 uur gepelleteerd bij 20.000xg, opgelost in runbuffer en geanalyseerd met 6% SDS-PAGE. Daarna worden eiwitten geblot op een nitrocellulosemembraan en geïncubeerd met monoklonale konijnenantilichamen die specifiek zijn voor humaan type I collageen. De immunoreactieve banden worden vervolgens geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en gedetecteerd door middel van verbeterde chemoluminescentietechniek (ECL).

   De effecten op differentiatie zullen worden geëvalueerd door de expressie van specifieke markers van osteoblastisch fenotype te analyseren, namelijk activiteit van alkalische fosfatase en productie van osteocalcine. Daarnaast zullen we de osteogene capaciteit van MSC's, uitgedrukt door extracellulaire matrixmineralisatie, evalueren. Confluente culturen worden geïncubeerd met een osteogeen medium bestaande uit dexametason 100 nM en beta-glycerofosfaat 10 mM. Als er osteogene capaciteit aanwezig is, verschijnen er binnen 2-4 weken calcificatienoduli. Om de matrixmineralisatie verder te bevestigen, zullen we het calciumgehalte meten en ten slotte een specifieke kleuring uitvoeren volgens de von Kossa-methode.

3. Analyse van de effecten van ijzerchelaatvormende moleculen op de proliferatie en differentiatie van MSC's We zullen de effecten evalueren van DFO, dat tot nu toe het meest gebruikte chelerende molecuul vertegenwoordigt in de therapie van thalassemie, ondanks de welbekende nadelen en toxiciteit. MSC-culturen, onbehandeld of behandeld met ijzerstapeling, zullen worden toegevoegd met DFO in concentraties die vergelijkbaar zijn met die verkregen in vivo na toediening van het geneesmiddel aan thalassemische patiënten. We analyseren het effect van de behandeling op de groeisnelheid, collageen type I-niveaus, activiteit van alkalische fosfatase, osteocalcineproductie en het osteogene vermogen.
4. Karakterisering van celcycluscomponenten in MSC's die zijn blootgesteld aan ijzerstapeling en/of DFO Het is algemeen bekend dat karakterisering van celcycluscomponenten de basis vormt voor het begrip van cruciale gebeurtenissen van proliferatie- en differentiatieprocessen.

Aldus werden celextracten verkregen uit beide MSC-celpopulaties behandeld zoals hierboven beschreven (d.w.z. ijzer, DFO of ijzerstapeling en/of desferrioxamine) zal worden geanalyseerd door middel van immunoblotting met behulp van antilichamen tegen verschillende eiwitcomponenten van de cyclus. Onder hen in het bijzonder: cycline Dl, D2 en D3, cycline E, cycline A; CDK4, CDK6, CDK2 en CDK1; p16, p14, p15, p21 en p27. Bovendien zullen de fosforylering van het retinoblastoma-eiwit en de cdk-activiteiten worden geanalyseerd.

B. Evaluatie van de effecten van neridronaat op de proliferatie en differentiatie van normale en thalassemische MSC's.

Het doel van deze studie is de in vitro analyse van de effecten van het neridronaat op normale en thalassemische menselijke MSC's. In het bijzonder zullen we evalueren of het medicijn, getest bij concentraties tussen 10(-4) M en 10(-6) M, zijnde 10(-5) M de therapeutische dosis, de levensvatbaarheid, proliferatie en cellulaire activiteit van MSC's beïnvloedt. De effecten op proliferatie zullen worden beoordeeld in termen van 3H-thymidine-opname, MTT-test en celcyclusmotormodulatie. De werking op differentiatie zal worden geëvalueerd door de expressie van specifieke markers te analyseren, namelijk type I collageenniveaus, alkalische fosfatase-activiteit en osteocalcineproductie. Daarnaast zullen we de osteogene capaciteit van MSC's evalueren, uitgedrukt door extracellulaire matrixmineralisatie, door de meting van calciumniveaus en door von Kossa-kleuring.

C. Fenotypische karakterisering van MSC's bereid uit thalassemische patiënten behandeld met of zonder neridronaat Het doel van deze studie zal zijn om te onderzoeken of de behandeling van thalassemische patiënten met neridronaat de osteoporotische aandoening positief kan beïnvloeden en tegelijkertijd het osteogene vermogen van MSC's. Daarom zullen we MSC's bereiden van thalassemische patiënten die al dan niet met neridronaat zijn behandeld en deze kweken volgens de standaardmethode. In het bijzonder zullen we de groeisnelheid, de celcyclusmachinerie, de collageenniveaus, de AP-activiteit en de osteocalcinesynthese analyseren. Het belangrijkste is dat we de extracellulaire matrixmineralisatie evalueren.