Etiologisk studie av Kawasakis sykdom

Pasientvalg og familieovervåking: Ved National Taiwan University Hospital i Taiwan vil vi studere pasienter som oppfyller kriteriene for Kawasaki sykdom eller atypisk Kawasaki sykdom og deres familiemedlemmer fra 2004 til desember 2005. Godkjenning fra Institutional Review Board vil bli innhentet for denne studien, og informert samtykke vil bli innhentet fra alle forsøkspersoner eller deres foreldre. Hvis pasienter ved legevakten, poliklinikken eller døgnavdelingen hadde kliniske syndromer som tyder på EV71-infeksjon, ble de og deres familiemedlemmer bedt om å delta i studien. Hals- og rektalprøver for virusisolering, og den første blodprøven. Kliniske manifestasjoner, forløp og utfall ble registrert. Hvis pasientene som var mistenkt for infeksjon på noe tidspunkt viste kliniske symptomer, ble de andre familiemedlemmene i samme husstand bedt om å gjennomgå screening ved virusisolering av strupeprøver, og fikk den første blodprøven. Spørreskjemabaserte intervjuer ble brukt til å samle inn informasjon inkludert demografiske data, antall soverom i husholdningen, kontakttid, mønster og tilstedeværelse av nåværende/nylige tegn og symptomer (hoste, rhinoré, sår hals, utslett, feber, magesmerter og diaré ) og tidligere kontakthistorie med personer utenfor husstanden som hadde klinisk sykdom. Oppfølgende telefonintervjuer gjentok spørsmål om tegn og symptomer med 2, 4 og 8 ukers mellomrom. Hvis et familiemedlem i husstanden rapporterte å oppleve tegn eller symptomer som tyder på Kawasakis sykdom i løpet av oppfølgingsperioden, vil husstandsmedlemmet motta ytterligere klinisk vurdering og gjentatt laboratorieundersøkelse for Kawasakis sykdom. En andre blodprøve ble tatt fra KD-tilfellene og alle deres familiemedlemmer 4 uker etter at den første blodprøven ble tatt. Valg av kontrolltilfelle: En alders- og kjønnsmatchet kontroll vil bli valgt tilfeldig. Kontrollen vil være de innlagte pasientene på samme avdeling som har andre diagnoser (som lungebetennelse, UVI, betennelse i mandlene). De vil også motta skjermen for virus- og bakterieopparbeidelse, slik husstandsmedlemmene gjør.

Definisjoner av Kawasaki sykdom og atypisk Kawasaki sykdom:

1. Kriterier for Kawasaki sykdom:

   • lik eller over fem av følgende: feber i mer enn 5 dager, ikke-purulent konjunktivitt, hudutslett, indurasjon i håndflaten/sålen og erytem etterfulgt av avskalling, halslymfadenopati, jordbærtunge- eller leppefissur/blødning
2. Atypisk Kawasaki sykdom; mindre enn fem av de ovennevnte, men med koronararterieaneurisme.

Laboratoriemetoder

1. Virusisolering og serotyping:

   Halsprøver, endetarmsprøver eller avføringsprøver ble levert for virusisolering. Prøver ble inokulert i human embryonal fibroblast, LLC-MK2, HEp-2 og rabdomyosarcoma (RD) cellekulturer. Når cytopatisk effekt involverte mer enn 50 % av cellemonolaget, ble cellene skrapet og utsatt for indirekte fluorescerende antistofffarging med spesifikke antistoffer (Chemicon International Inc., Temecula, CA) eller typet ved spesifikke metoder i henhold til de mistenkte typene virus.

2. Molekylær diagnose for virus eller andre patogener som er vanskelig å dyrke:

   1. Viral RNA- og RNA-ekstraksjon: RNA- og DNA-ekstraksjon vil bli utført ved å bruke Isolation Kit i henhold til produsentens veiledning. (RNA-ekstraksjonssett, Qiagen). 140 ul av svelgpinne ble blandet med AVL-buffer i 10 til 15 minutter ved romtemperatur. Deretter spinner du ned blandingen. Tilsett 560 uL 100 % alkohol i pelleten og inkuber i minst 10 minutter ved romtemperatur. Blandingen settes inn i spinnkolonnen og sentrifugeres ved 8000 rpm i 1 minutt to ganger. Deretter vil 500uL AW1-buffer tilsettes og blandingen sentrifugeres ved 80000 rpm i 1 minutt, og deretter vil 500uL AW2-buffer tilsettes og sentrifugeres ved 14000 rpm i 3 minutter. Kast løsningen og sentrifuger ved 14000 rpm i 2 minutter. Til slutt vil 25 til 30 ul AVE-buffer tilsettes og sentrifugeres ved 8000 til 10000 rpm i 1 minutt.
   2. Revers transkripsjon: RT vil bli utført med 1. streng cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (Roche). Bland tidligere ekstrahert RNA med reagenser inkludert buffer, MgCl2, dNTP, Oligo-p(dT)15-primer, RNase-hemmer, revers transkriptase, vortex kort, inkuber reaksjonen ved 25oC i 10 minutter og deretter 42oC i 60 minutter. Inkuber til slutt ved 99oC i 5 minutter og avkjøl deretter til 4oC i 5 minutter.
   3. Sanntids TagMan PCR for enterovirus, adenovirus eller annen viral etiologi. Primerne og probene for enterovirus og andre virus sanntids PCR er i følgende tabell. Primere og prober for PanEV ble valgt basert på svært konserverte regioner i den 5'-utranslaterte regionen av enterovirusgenomet. Primerne og probene for EV71 ble valgt basert på de mest forskjellige og spesifikke genetiske regionene i VP1-regionen av enterovirusgenomet. Andre potensielle virus, som adenovirus, eller andre respiratoriske virus vil også bli utført ved PCR eller RT-PCR eller sanntids PCR etter reglene i prosedyrene ovenfor.
   4. Representativ differensialanalyse etterfulgt av subtraktiv kloning
3. Bakteriekulturer og toksindeteksjon: Kulturer ble hentet fra svelget og endetarmen hos pasienter med akutt KD før starten av den intravenøse infusjonen med immunglobulin og fra kontrollpasienter med bruk av et Baxter Diagnostics Culturette-system som inneholder en bomullspinne. Det primære datainnsamlingsarket ble fylt ut og holdt på stedet der prøvene ble tatt. Platene ble deretter undersøkt for alle â-hemolytiske gruppe A streptokokker og alle S aureus som var koagulasepositive ved rørtesten. Disse isolatene ble deretter screenet på en blind måte for tilstedeværelse av bakteriell superantigenproduksjon ved immundiffusjon med antisera mot kjente stafylokokk- og streptokokksuperantigener som beskrevet tidligere. (Lee PK og Schlieveret PM).
4. Serologisk test: Serologiske tester for antistoffpåvisning av Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO vil bli målt med kommersielle sett. Nøytraliserende antistoff for enterovirus vil bli utført etter standardprotokollen for nøytraliseringstesten på mikrotiterplater. EV71 isolat TW/2272/98 ble amplifisert og renset som et antigen for m-capture ELISA for EV71 IgM Detection. Hvis potensielt patogen er definert, vil ytterligere serologisk test for det spesifikke patogenet bli utført senere.
5. Statistisk analyse: Data ble analysert med SAS Statistical Package (versjon 8.2, SAS Institute, Cary, North Carolina). Vi brukte Students t-test for kontinuerlige variabler og c 2-test for kategoriske data. Etter at univariat analyse screenet statistisk signifikante variabler, ble trinnvis multippel logistisk regresjonsanalyse utført for å justere konfoundere samtidig og for å beregne multivariatjusterte oddsforhold. Nivået på modellvalg ble satt til 0,15 for inn-og-ut-modeller. P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.