Skuteczność i bezpieczeństwo neridronianu (Nerixia®) w leczeniu osteoporozy u pacjentów z TM i TI (Nerixia)

Cel badania W chwili obecnej, ze względu na globalne podejście terapeutyczne, rokowanie w przypadku talasemii major i ciężkiej talasemii pośredniej jest otwarte. Regularne transfuzje od dzieciństwa i wczesna chelatacja żelaza zapobiegają deformacjom kości, które w przeszłości charakteryzowały tę chorobę, mimo że według kilku autorów wysoki odsetek pacjentów cierpi na osteopenię-osteoporozę. To uporczywe powikłanie można wytłumaczyć jednym lub kilkoma współistniejącymi czynnikami, takimi jak niedokrwistość, czynniki genetyczne, hormony płciowe biorące udział w metabolizmie kości, terapia żelazem i chelatacją, niedoczynność tarczycy, niskie lub poniżej normy stężenie witaminy D w surowicy itp.

Ból okazał się jedynym parametrem, który można uznać za odróżniający pacjentów z Talasemią Major od zdrowych pacjentów w tym samym wieku poprzez ankietę dotyczącą jakości życia przeprowadzoną w Centrum Genui. Częściej ból jest zlokalizowany w kręgach lędźwiowych, często jest opisywany za pomocą nieprawdziwych zdjęć i należy go odnosić do osteoporozy trzonów kręgów.

Częstość złamań samoistnych obserwowana w specjalistycznych ośrodkach leczących te patologie wzrasta.

Talasemia pośrednia jest eterogenną jednostką kliniczną obejmującą szeroki zakres fenotypów, od form łagodnych do ciężkich. W łagodnych postaciach stężenie hemoglobiny waha się w granicach 8-9 g/dl, co jest stabilne bez konieczności regularnej transfuzji, chyba że współistniejący epizod nasila anemię; nie obserwuje się ekspansji szpiku kostnego. Istnieją natomiast formy, w których niedokrwistość jest stale cięższa (6,5-7,5 g/dl) z wyraźnie nieskuteczną erytropoezą. W takich przypadkach, zwłaszcza gdy diagnoza jest postawiona w dzieciństwie, pacjenci powinni otrzymać schemat transfuzji podobny do głównych postaci z podobnymi powikłaniami, takimi jak osteoporoza.

Z tych powodów u pacjentów dotkniętych ciężką talasemią pośrednią i talasemią główną ważna jest profilaktyka i wczesne rozpoznanie osteoporozy, a także leczenie ustalonej choroby w celu zarówno poprawy jakości życia, jak i długości życia.

We wcześniej opisanych próbach terapeutycznych wykazano skuteczność bisfosfonianów ze względu na ich zdolność do hamowania resorpcji kości oraz stosunkowo nieliczne działania niepożądane skutkujące zwiększeniem gęstości kości. Ponieważ wszystkie poprzednie badania przeprowadzono na niewielkiej liczbie pacjentów, proponujemy randomizowane, otwarte, duże, wieloośrodkowe badanie w celu sprawdzenia skuteczności neridronianu. Możliwość podawania tego leku dożylnie co 90 dni upraszcza schematy dawkowania i zmniejsza częstość podawania. Są to ważne czynniki poprawiające przestrzeganie zaleceń terapeutycznych u pacjentów już poddanych dużemu dziennemu obciążeniu terapeutycznemu.

Główne cele Głównym celem tego badania jest ocena skuteczności neridronianu (aminobisfosfonianu trzeciej generacji, który, jak wykazano w kilku badaniach klinicznych, ma zdolność hamowania resorpcji kości za pośrednictwem osteoklastów) w zwiększaniu gęstości masy kostnej (BMD) mierzonej poprzez podwójną densytometrię rentgenowską (DXA). Densytometria kości będzie wykonywana na skriningu podstawowym, a następnie po 6, 12, 18, 24 miesiącach od rozpoczęcia leczenia.

Cele drugorzędne Wpływ neridronianu na obrót kostny zostanie oceniony za pomocą fosfatazy zasadowej kości (BALP) i C-końca telopeptydu kolagenu surowiczego typu 1 (CTX-s), podczas badania przesiewowego, a następnie po 6, 12, 18, 24 miesiącach od początek leczenia.

Dozowanie markerów będzie scentralizowane. Projekt badania Włoskie, wieloośrodkowe, randomizowane, otwarte badanie terapeutyczne oceniające skuteczność i bezpieczeństwo neridronianu w leczeniu osteoporozy u pacjentów z talasemią dużą i ciężką talasemią pośrednią.

Skuteczność i bezpieczeństwo leku będą oceniane mierząc przy każdej wizycie następujące parametry:

• hematologiczne: hemochrom
• biochemia krwi: kreatynina, BUN, AST, ALT, Ca, P, elektroforeza białek, białka całkowite.

Częstość występowania zwapnień pozamacicznych i zespołu przypominającego pseudoxantoma elasticum (PXE) oraz ich obserwacja zostaną ocenione na początku badania w porównaniu z 24 miesiącami poprzez badanie fizykalne, echografię jamy brzusznej i badanie dna oka.

Podczas badania rejestrowane będą inne znane czynniki ryzyka osteoporozy, w tym częstość występowania i częstość złamań kości oraz, jeśli zostaną wykonane, polimorfizmy. COLIA1 Na początku badania oraz w 12. Ponadto dane dotyczące QOL i bólu objawowego zostaną ocenione poprzez zastosowanie skali SF-36.

Podczas badania wszystkie zdarzenia niepożądane będą rejestrowane

Badanie rozszerzone:

Cele badania rozszerzonego

1. Analiza in vitro wpływu przeciążenia żelazem i cząsteczek chelatujących na wzrost mezenchymalnych komórek macierzystych i różnicowanie osteogenne
2. Ocena wpływu neridronianu na proliferację i różnicowanie normalnych i talasemicznych MSC.
3. Charakterystyka fenotypowa MSC przygotowanych od pacjentów z talasemią leczonych nerydronianem lub bez niego Projekt badania A. Analiza in vitro wpływu przeciążenia żelazem i cząsteczek chelatujących na wzrost MSC i różnicowanie osteogenne B. Ocena wpływu neridronianu na proliferację prawidłowych i talasemicznych MSC i różnicowanie.

C. Charakterystyka fenotypowa MSC przygotowanych od pacjentów z talasemią leczonych neridronianem lub bez A. Analiza in vitro wpływu przeciążenia żelazem i cząsteczek chelatujących na wzrost MSC i różnicowanie osteogenne

1. Przygotowanie kolekcji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego od zdrowych osób Aby wyizolować i przygotować MSC, wykorzystamy protokół opisany szczegółowo w Oliva i in. glin. (Molec. i komórka. Biochem., 2003, 247:55-60). Szczegóły przygotowania MSC znajdują się w załącznikach.

   Komórki wyrażały specyficzne markery powierzchniowe, takie jak CD13, CD29, CD44, CD105, CD166, i były negatywne dla markerów komórek krwiotwórczych CD14, CD34 i CD45.

   W ten sposób przygotowujemy normalny bank MSC, na którym przeprowadzamy eksperymenty. Obecnie mamy już dostępnych ponad 10 preparatów MSC pochodzących od osób zdrowych.

2. Analiza wpływu przeładowania żelazem na proliferację i różnicowanie MSC Chociaż dobrze wiadomo, że osoby z talasemią są przeładowane żelazem, w literaturze nie ma dostępnych danych na temat wpływu tego metalu na proliferację i różnicowanie MSC. W tym celu będziemy postępować jak wskazano poniżej. Ocenimy szybkość proliferacji oraz poziomy wewnątrzkomórkowe żelaza i ferrytyny w MSC w fazie logarytmicznej inkubowanej ze wzrastającymi stężeniami żelaza, zaczynając od fizjologicznych ilości hematycznych, tj. 2-18 mikrogramów/ml, aż do osiągnięcia wartości 10-krotnie wyższych, zbliżonych do występujących u pacjentów z talasemią. Przeanalizujemy wpływ na szybkość wzrostu poprzez bezpośrednie zliczanie komórek, test żywotności MTT i inkorporację 3H-tymidyny (synteza DNA).

   Sukcesywnie przeanalizujemy wpływ przeciążenia żelazem na poziomy głównego produktu białkowego MSC, a mianowicie kolagenu typu I, zgodnie z raportowanym protokołem. Konfluentne hodowle wczesnych pasaży (0-3) MSC, nietraktowane i traktowane przeładowaniem żelazem, poddaje się tripinizacji, liczy i odwirowuje przy 800 xg. Osady ponownie zawiesza się w 0,5 M kwasie octowym zawierającym 250 mikrogramów/ml pepsyny.

   Po 16 godzinach delikatnego wytrząsania w 4°C, nierozpuszczalną pozostałość osadzono przy 20 000 x g przez 1 godzinę, rozpuszczono w buforze do analizy i analizowano za pomocą 6% SDS-PAGE. Następnie białka przenoszono na membranę nitrocelulozową i inkubowano z króliczymi przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla ludzkiego kolagenu typu I. Immunoreaktywne prążki są następnie inkubowane z drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową i wykrywane za pomocą techniki wzmocnionej chemiluminescencji (ECL).

   Wpływ na różnicowanie zostanie oceniony poprzez analizę ekspresji specyficznych markerów fenotypu osteoblastów, a mianowicie aktywności fosfatazy alkalicznej i produkcji osteokalcyny. Ponadto ocenimy zdolność osteogenną MSC wyrażoną przez mineralizację macierzy pozakomórkowej. Konfluentne hodowle inkubuje się z pożywką osteogenną składającą się z 100 nM deksametazonu i 10 mM beta-glicerofosforanu. Jeśli występuje zdolność osteogenna, guzki zwapniające pojawiają się w ciągu 2-4 tygodni. Aby dodatkowo potwierdzić mineralizację matrycy, zmierzymy poziom wapnia, a na koniec wykonamy specyficzne barwienie metodą von Kossa.

3. Analiza wpływu cząsteczek chelatujących żelazo na proliferację i różnicowanie MSC Ocenimy wpływ DFO, które jest do tej pory najczęściej stosowaną cząsteczką chelatującą w terapii talasemii, pomimo dobrze znanych wad i toksyczności. Hodowle MSC, nietraktowane lub traktowane przeładowaniem żelazem, zostaną dodane z DFO w stężeniach podobnych do uzyskiwanych in vivo po podaniu leku pacjentom z talasemią. Przeanalizujemy wpływ zabiegu na tempo wzrostu, poziom kolagenu typu I, aktywność fosfatazy alkalicznej, produkcję osteokalcyny, a także zdolności osteogenne.
4. Charakterystyka składników cyklu komórkowego w MSC poddanych przeciążeniu żelazem i/lub DFO Powszechnie wiadomo, że charakterystyka składników cyklu komórkowego stanowi podstawę do zrozumienia kluczowych zdarzeń procesów proliferacji i różnicowania.

Zatem ekstrakty komórkowe otrzymane z obu populacji komórek MSC potraktowanych jak opisano powyżej (tj. żelazo, DFO lub przeciążenie żelazem i/lub desferrioksamina) będą analizowane przez immunoblotting z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko kilku białkowym składnikom cyklu. Wśród nich w szczególności: cyklina D1, D2 i D3, cyklina E, cyklina A; CDK4, CDK6, CDK2 i CDK1; p16, p14, p15, p21 i p27. Ponadto przeanalizowana zostanie fosforylacja białka siatkówczaka oraz aktywność cdk.

B. Ocena wpływu neridronianu na proliferację i różnicowanie normalnych i talasemicznych MSC.

Celem tego badania będzie analiza in vitro wpływu neridronianu na normalne i talasemiczne ludzkie MSC. W szczególności ocenimy, czy lek badany w stężeniach pomiędzy 10(-4) M a 10(-6) M, czyli 10(-5) M dawka terapeutyczna, wpływa na żywotność, proliferację i aktywność komórkową MSC. Wpływ na proliferację zostanie oceniony pod kątem włączania 3H-tymidyny, testu MTT i modulacji silnika cyklu komórkowego. Wpływ na różnicowanie zostanie oceniony poprzez analizę ekspresji specyficznych markerów, a mianowicie poziomów kolagenu typu I, aktywności fosfatazy alkalicznej i produkcji osteokalcyny. Ponadto ocenimy zdolność osteogenną MSC wyrażoną przez mineralizację macierzy pozakomórkowej, pomiar poziomu wapnia i barwienie von Kossa.

C. Charakterystyka fenotypowa MSCs przygotowanych od pacjentów z talasemią leczonych lub nie leczonych nerydronianem Celem tego badania będzie zbadanie, czy leczenie pacjentów z talasemią nerydronianem może pozytywnie wpłynąć na stan osteoporotyczny i jednocześnie poprawić zdolności osteogenne MSC. Dlatego przygotujemy MSC od pacjentów z talasemią leczonych lub nie leczonych neridronianem i hodujemy je zgodnie ze standardową metodą. W szczególności przeanalizujemy tempo wzrostu, mechanizm cyklu komórkowego, poziomy kolagenu, aktywność AP i syntezę osteokalcyny. Przede wszystkim ocenimy mineralizację macierzy pozakomórkowej.