Mikropęcherzyki i monocyty do przewidywania śmiertelności pacjentów z marskością wątroby (PROMICE)

Historia naturalna marskości

Marskość jest schyłkową postacią przewlekłej choroby wątroby. Szacuje się, że we Francji na marskość wątroby choruje od 200 000 do 500 000 osób. Marskość jest przyczyną ponad 170 000 zgonów rocznie w Europie.

Do głównych przyczyn marskości wątroby należy nadmierne spożywanie alkoholu, główna przyczyna w Europie, oraz przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby typu B i C, które jest główną przyczyną w Azji i Afryce. Ponadto obecna epidemia otyłości i cukrzycy typu 2 na całym świecie doprowadziła do gwałtownego wzrostu częstości występowania niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby związanego z zespołem metabolicznym, szczególnie w Ameryce Północnej.

Marskość jest definiowana histologicznie jako rozlana zmiana w architekturze wątroby przez zwłóknienie pierścieniowe związane z guzkami regeneracyjnymi. Wraz z pojawieniem się nieinwazyjnych testów umożliwiających pomiar włóknienia, marskość wątroby jest obecnie uznawana za wysoce prawdopodobną, gdy elastyczność wątroby mierzona za pomocą Fibroscan® wynosi > 15 kPa.

Pacjenci z marskością wątroby mogą być całkowicie bezobjawowi i mieć prawidłową czynność wątroby. W tym przypadku wynik Child-Pugh, który ocenia ciężkość marskości wątroby, to „A”. Jednak nasilenie marskości może się nasilić, powodując rozwój objawów niewydolności wątroby, takich jak żółtaczka, zmniejszone czynniki krzepnięcia i hipoalbuminemia i (lub) wodobrzusze lub encefalopatia wątrobowa. Marskość wątroby jest następnie klasyfikowana jako B lub C w skali Childa-Pugha.

Progresja marskości wiąże się z różnymi procesami: z jednej strony powolnym i ciągłym pogarszaniem się związanym z utrzymującym się uszkodzeniem wątroby przez jeden lub więcej czynników przyczynowych (alkohol i/lub zespół metaboliczny i/lub wirus), a z drugiej strony szybkim nasilenia występującego z ostrymi powikłaniami choroby, takimi jak krwawienie z żylaków lub zakażenia bakteryjne. Rzeczywiście, marskość jest związana z poważnymi zmianami we wrodzonej odporności, które sprzyjają ciężkim infekcjom bakteryjnym, które mogą prowadzić do niewydolności narządów. Takie powikłanie stanowi punkt zwrotny w naturalnej historii marskości wątroby, ponieważ przejście od wyrównanej do niewyrównanej marskości wiąże się ze zmniejszeniem rocznego przeżycia z 95 do 60%. Gdy te powikłania są związane z niewydolnością narządów, śmiertelność krótkoterminowa dramatycznie wzrasta, a jedna trzecia pacjentów umiera w ciągu jednego miesiąca. Związek ostrej dekompensacji marskości wątroby z niewydolnością jednego lub więcej narządów został niedawno zdefiniowany jako nowy zespół nazwany ostrą niewydolnością wątroby z przewlekłą niewydolnością wątroby (ACLF).

Jedynym sposobem leczenia marskości wątroby jest przeszczep wątroby (LT). Jednak każdego roku od 10 do 15% pacjentów na francuskiej liście oczekujących na przeszczep wątroby nie ma dostępu do przeszczepu i umiera przedwcześnie z powodu ostrego powikłania marskości wątroby. Ponadto wielu pacjentów umiera, zanim jeszcze zostaną umieszczeni na liście oczekujących na przeszczep, o czym świadczą wyniki niedawnego francuskiego wieloośrodkowego badania, które wykazało, że 6-miesięczny wskaźnik śmiertelności pacjentów z niewyrównaną marskością wątroby, dziecko C, pozostaje równy 25% [8].

Przewidywanie wyniku jest zatem głównym wyzwaniem w leczeniu pacjentów z marskością wątroby.

Przewidywanie wyników pacjentów z marskością wątroby: wyniki kliniczne.

Obecnie przewidywanie wyników pacjentów z marskością wątroby opiera się na skali MELD (Model for End-Stage Liver Disease). Wynik MELD obejmuje trzy obiektywne kryteria laboratoryjne (INR, bilirubina w surowicy i kreatynina w surowicy). Została założona w 2000 roku w kohorcie amerykańskiej w celu przewidywania ryzyka zgonu po 3 miesiącach od założenia TIPS (Transjugular Intrahepatic Portosystemic Shunt). Jego zastosowanie bardzo szybko rozszerzono o przewidywanie 3-miesięcznego przeżycia pacjentów z marskością wątroby znajdujących się na liście oczekujących na przeszczep. Od 2007 roku we Francji przydział przeszczepów opiera się na punktacji MELD, przy czym pacjenci z najwyższym wynikiem są przeszczepiani jako pierwsi.

Od tego czasu wartość predykcyjna MELD była badana w dużych kohortach, wykazując, że wydajność MELD w przewidywaniu śmierci jest niewielka, z obszarami pod krzywymi ROC (AUROC) w zakresie od 0,64 do 0,72 [3, 7, 19, 20]. W 2014 roku, 7 lat po wprowadzeniu skali MELD, stwierdzono, że 11,5% pacjentów na liście oczekujących na przeszczep wątroby nadal zmarło, zanim można było ich przeszczepić. Dane te ilustrują potrzebę poprawy naszej zdolności przewidywania śmierci pacjentów z zaawansowaną marskością wątroby.

Z tej perspektywy niektórzy autorzy próbowali poprawić wynik MELD, dodając jedną lub więcej zmiennych, takich jak sód w surowicy (MELD-Na=MELD-Na-[0,025×MELD×(140 - Na)] + 140). Wkład tych zmodyfikowanych wyników MELD nie został uznany za wystarczający do promowania ich stosowania w praktyce klinicznej, pozostawiając cel poprawy MELD niespełniony.

Przewidywanie wyników pacjentów z marskością wątroby: nowe biomarkery

Poza wynikami klinicznymi niektóre biomarkery wyglądają obiecująco. Rzeczywiście, w ramach ścisłej współpracy między oddziałami klinicznymi szpitala Beaujon (hepatologia i anestezjologia-resuscytacja) a zespołami Inserm (dr E Weiss, dr R. Moreau, Inserm U1149, Centre de recherche sur l'inflammation, Paryż) i PE Rautou, Dr C. Boulanger, Inserm U970; Centre de recherche cardiovasculaire, Paryż) ostatnio zidentyfikowano dwa rodzaje biomarkerów, które przewidują przeżycie pacjentów z marskością wątroby.

Mikropęcherzyki to pęcherzyki uwalniane do środowiska pozakomórkowego podczas aktywacji komórki lub apoptozy, dwóch zjawisk silnie związanych z marskością wątroby. Zespół Inserm U970 (Pr PE Rautou, dr C. Boulanger) wykazał w 2012 roku, że stężenie krążących mikropęcherzyków hepatocytów wzrasta wraz z ciężkością marskości wątroby. Ponadto mikropęcherzyki u pacjentów z marskością wątroby typu B lub C sprzyjają nadciśnieniu wrotnemu poprzez indukowanie hiporeaktywności tętnic na czynniki zwężające naczynia. Na podstawie tych wyników prospektywne badanie obejmujące 242 pacjentów z marskością wątroby wykazało, że krążące stężenia mikropęcherzyków hepatocytów są w stanie przewidzieć przeżycie po 6 miesiącach pacjentów z marskością wątroby niezależnie od wyniku MELD.

Podatność pacjentów z marskością wątroby na ciężkie infekcje jest związana z nieprawidłowościami w ich wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, aw szczególności z występowaniem nadmiernej odpowiedzi zapalnej, odpowiedzialnej za niewydolność narządową. Interferony typu 1 (IFN 1) są mediatorami stanu zapalnego, których wpływ na rokowanie w sepsie może być szkodliwy. Aby ustalić, czy aktywność szlaku IFN typu 1 była zaangażowana w deregulację wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i podatność na posocznicę pacjentów z marskością wątroby, zespół Inserm U1149 zmierzył, stosując ilościową PCR w czasie rzeczywistym, sygnaturę genu (wynik IFN) odzwierciedlający aktywację tego szlaku w komórkach odpornościowych 99 pacjentów ze zdekompensowaną marskością wątroby hospitalizowanych na oddziale wątroby w szpitalu Beaujon. Badacze wykazali zatem, że wynik IFN jest w stanie przewidzieć ryzyko zgonu pacjentów z marskością wątroby niezależnie od wyniku MELD z AUROC równym 0,79 (0,7 dla MELD).

Należy zauważyć, że te dwa biomarkery (mikropęcherzyki hepatocytów i wynik IFN) odzwierciedlają różne i uzupełniające się procesy patofizjologiczne: mikropęcherzyki hepatocytów odzwierciedlają przetrwałe uszkodzenie wątroby, podczas gdy wynik IFN odzwierciedla wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Należy również zauważyć, że te biomarkery, chronione dwoma patentami międzynarodowymi (EP121528133.5 i EP2016/077129), można mierzyć na krwi obwodowej przy użyciu prostych i łatwo dostępnych technik (ELISA/filtracja, qPCR).

hipotezy

W ramach tego projektu badacze stawiają hipotezę, że przewidywanie śmierci pacjentów z zaawansowaną marskością wątroby (Child-Pugh B lub C) za pomocą złożonego wyniku łączącego stężenie krążących mikropęcherzyków hepatocytów, wynik IFN i wynik MELD będzie lepsze niż oceniane za pomocą wyniku MELD sam.

Ten złożony wynik pomoże lekarzom ocenić pilność przeszczepu wątroby, a tym samym udoskonalić kryteria przydziału przeszczepów wątroby. Ten złożony wynik może również identyfikować populację pacjentów ze szczególnym ryzykiem zgonu, którzy powinni być poddani zwiększonemu nadzorowi podczas oczekiwania na przeszczep wątroby. Dzięki tym dwóm podejściom (lepsze ustalanie priorytetów pacjentów do przeszczepu wątroby i wzmożone monitorowanie pacjentów wysokiego ryzyka) ta nowa złożona ocena zmniejszy śmiertelność pacjentów z marskością wątroby oczekujących na przeszczep wątroby.

Wreszcie, regularnie testowane są nowe podejścia terapeutyczne mające na celu poprawę przeżycia pacjentów z ciężką marskością wątroby oczekujących na przeszczep wątroby (np. poprzez zmniejszenie częstości występowania powikłań). Złożony wynik zaproponowany przez badaczy może być również wykorzystany jako „towarzysz” do monitorowania skuteczności tych nowych metod leczenia.

Populacja

Pacjenci z marskością wątroby typu B lub C w skali Childa-Pugha (potwierdzoną biopsją wątroby, nieinwazyjną metodą oceny ilościowej zwłóknienia lub kombinacją objawów klinicznych, biologicznych i radiologicznych, patrz powyżej) zostaną włączeni do badania na okres dwóch lat.

Pacjenci będą włączani podczas wizyt kontrolnych w ambulatorium hepatologicznym lub podczas planowej hospitalizacji, np. na endoskopię przewodu pokarmowego w celu przesiewowego badania objawów nadciśnienia wrotnego lub usunięcia wodobrzusza. Będą więc w stabilnym stanie.

Obecność ostrych zdarzeń lub zdarzeń, które mogą modyfikować ryzyko zgonu lub przeszczepu wątroby i/lub odpowiedź zapalną lub uwolnienie mikropęcherzyków będzie jednym z kryteriów niewłączenia (patrz wyżej).

Pomiary biomarkerów

Po uzyskaniu świadomej zgody od pacjentów biorących udział w badaniu zostanie pobranych od piętnastu do dwudziestu mililitrów krwi żylnej obwodowej (3 probówki z EDTA i 3 probówki z cytrynianem)

W przypadku mikropęcherzyków hepatocytów probówki z cytrynianem zostaną dwukrotnie odwirowane, a następnie zamrożone w temperaturze -80°C do czasu analizy.

W przypadku wyniku IFN krew zawarta w 3 probówkach z EDTA zostanie wykorzystana do wyizolowania jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC). PBMC zostaną poddane lizie w celu uzyskania RNA, które będzie przechowywane w temperaturze -80°C do czasu zmierzenia wyniku IFN.

Pod koniec 2-letniego okresu włączenia, pomiary mikropęcherzyków hepatocytów i IFN zostaną wykonane dla wszystkich pacjentów w okresie 1 roku. Stężenia mikropęcherzyków hepatocytów w osoczu zostaną określone na osoczu bezpłytkowym przy użyciu testu ELISA/filtracji. Aby zmierzyć wynik IFN, RNA z wcześniej wyizolowanych PBMC zostanie najpierw poddany odwrotnej transkrypcji. Następnie zmierzona zostanie ekspresja pięciu interesujących mRNA w celu obliczenia wyniku IFN.

Główny punkt końcowy

Pierwszorzędowym punktem końcowym jest pole pod krzywą ROC złożonego wyniku obejmującego MELD, stężenie mikropęcherzyków w hepatocytach i wynik IFN do przewidywania skumulowanej częstości zgonu po 6 miesiącach (biorąc pod uwagę przeszczep wątroby jako ryzyko konkurencyjne) w porównaniu z polem pod krzywą ROC samego wyniku MELD.

Pomiar pierwszorzędowego punktu końcowego zostanie przeprowadzony zgodnie z zaleceniami specyficznymi dla analizy przeżycia u pacjentów z marskością wątroby, z wykorzystaniem analizy przeżycia uwzględniającej przeszczepienie wątroby jako ryzyko konkurencyjne. Dane od pacjentów, którzy nie zmarli lub nie zostali przeszczepieni, zostaną ocenzurowane na koniec obserwacji lub w dniu ostatniej wiadomości (w przypadku utraty pacjenta z obserwacji) lub w dniu zakończenia uczestnictwa (w w przypadku rezygnacji z uczestnictwa). Okres obserwacji wyniesie jeden rok po włączeniu (maksymalnie 13 miesięcy w przypadku pacjentów, którym przeszczepiono 12. miesiąc po włączeniu). Zaplanowana zostanie wizyta kontrolna po 6 i 12 miesiącach od włączenia. Dane o ewentualnych zgonach lub przeszczepach będą pozyskiwane podczas tej wizyty, z wykorzystaniem dokumentacji medycznej lub po rozmowach telefonicznych z pacjentami lub ich bliskimi. W przypadku osób, które nie są objęte obserwacją, do CépiDc zostaną skierowane prośby o uzyskanie statusu życiowego. Dane dotyczące ewentualnych przeszczepów będą pozyskiwane poprzez prośbę o dostęp do bazy danych „Cristal” (https://www.sipg.sante.fr) opracowany przez Agence de la biomédecine.