Изучение этиологии болезни Кавасаки

Отбор пациентов и семейное наблюдение: в больнице Национального Тайваньского университета на Тайване мы будем изучать пациентов, которые соответствуют критериям болезни Кавасаки или атипичной болезни Кавасаки, и членов их семей с 2004 по декабрь 2005 года. Для этого исследования будет получено одобрение Институционального наблюдательного совета, а информированное согласие будет получено от всех субъектов или их родителей. Если у пациентов службы неотложной помощи, поликлиники или стационара были клинические синдромы, указывающие на инфекцию EV71, их и членов их семей приглашали принять участие в исследовании. Мазки из горла и прямой кишки для выделения вируса и первый образец крови. Регистрировали клинические проявления, течение и исходы. Если в какой-либо момент у пациентов с подозрением на инфекцию появлялись клинические симптомы, других членов семьи в том же домашнем хозяйстве просили пройти скрининг путем выделения вируса из мазков из зева и получали первый образец крови. Для сбора информации, включая демографические данные, количество спален в домохозяйстве, время контакта, характер и наличие текущих/недавних признаков и симптомов (кашель, ринорея, боль в горле, сыпь, лихорадка, боль в животе и диарея) использовались опросы на основе вопросников. ) и предшествующий анамнез контактов с людьми вне семьи, у которых было клиническое заболевание. Последующие телефонные интервью повторяли вопросы о признаках и симптомах с интервалом в 2, 4 и 8 недель. Если какой-либо член семьи сообщил о появлении признаков или симптомов, указывающих на болезнь Кавасаки, в течение периода последующего наблюдения, член семьи получит дополнительную клиническую оценку и повторное лабораторное исследование на болезнь Кавасаки. Второй образец крови был получен от больных БК и всех членов их семей через 4 недели после получения первого образца крови. Выбор контрольного случая: случайным образом будет выбран контрольный случай соответствующего возраста и пола. Контролем будут госпитализированные пациенты той же палаты с другими диагнозами (такими как пневмония, ИМП, тонзиллит). Они также получат проверку на вирусы и бактерии, как и члены семьи.

Определения болезни Кавасаки и атипичной болезни Кавасаки:

1. Критерии болезни Кавасаки:

   • равно или более пяти из следующих: лихорадка в течение более 5 дней, негнойный конъюнктивит, кожная сыпь, уплотнение ладоней / подошв и эритема с последующим шелушением, лимфаденопатия шеи, земляничный язык или трещина / кровотечение губы
2. Атипичная болезнь Кавасаки; менее пяти из вышеперечисленных, но с аневризмой коронарной артерии.

Лабораторные методы

1. Выделение вируса и серотипирование:

   Мазки из горла, ректальные мазки или образцы стула были отправлены для выделения вируса. Образцы инокулировали в культуры эмбриональных фибробластов человека, LLC-MK2, HEp-2 и рабдомиосаркомы (RD). Когда цитопатический эффект затрагивал более 50% клеточного монослоя, клетки соскабливали и подвергали непрямому флуоресцентному окрашиванию специфическими антителами (Chemicon International Inc., Темекула, Калифорния) или типировали специфическими методами в соответствии с предполагаемыми типами вирусов.

2. Молекулярная диагностика вирусов или других трудно культивируемых патогенов:

   1. Экстракция вирусной РНК и РНК: Экстракция РНК и ДНК будет проводиться с использованием набора для изоляции в соответствии с руководством производителя. (набор для выделения РНК, Qiagen). 140 мкл мазка из зева смешивали с буфером AVL в течение 10–15 минут при комнатной температуре. Затем раскрутите смесь. Добавьте 560 мкл 100% спирта в осадок и инкубируйте не менее 10 минут при комнатной температуре. Смесь помещают в спин-колонку и дважды центрифугируют при 8000 об/мин в течение 1 минуты. Затем добавляют 500 мкл буфера AW1 и смесь центрифугируют при 80000 об/мин в течение 1 минуты, а затем добавляют 500 мкл буфера AW2 и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 3 минут. Слейте раствор и центрифугируйте при 14000 об/мин в течение 2 минут. Наконец, добавляют от 25 до 30 мкл буфера AVE и центрифугируют при 8000–10000 об/мин в течение 1 минуты.
   2. Обратная транскрипция: ОТ будет выполняться с использованием набора для синтеза кДНК 1-й цепи для ОТ-ПЦР (Roche). Смешайте ранее выделенную РНК с реагентами, включая буфер, MgCl2, dNTP, праймер Oligo-p(dT)15, ингибитор РНКазы, обратную транскриптазу, кратковременно вортексируйте, инкубируйте реакционную смесь при 25°C в течение 10 минут, а затем при 42°C в течение 60 минут. Наконец, инкубируйте при 99°C в течение 5 минут, а затем охладите до 4°C в течение 5 минут.
   3. ПЦР TagMan в реальном времени на энтеровирус, аденовирус или другую вирусную этиологию. Праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени для энтеровирусов и других вирусов приведены в следующей таблице. Праймеры и зонды для PanEV были выбраны на основе высококонсервативных областей в 5'-нетранслируемой области генома энтеровируса. Праймеры и зонды для EV71 были выбраны на основе наиболее разнообразных и специфичных генетических областей в области VP1 генома энтеровируса. Другие потенциальные вирусы, такие как аденовирусы или другие респираторные вирусы, также будут проводиться с помощью ПЦР, ОТ-ПЦР или ПЦР в реальном времени в соответствии с правилами описанных выше процедур.
   4. Репрезентативный дифференциальный анализ с последующим субтрактивным клонированием
3. Бактериальные культуры и обнаружение токсина: Культуры были получены из глотки и прямой кишки пациентов с острой БК до начала внутривенной инфузии иммуноглобулина и от контрольных пациентов с использованием системы Baxter Diagnostics Culturette, содержащей ватный тампон. Лист сбора первичных данных был заполнен и хранился в месте, где были получены образцы. Затем планшеты исследовали на наличие всех β-гемолитических стрептококков группы А и всех золотистых стафилококков, коагулазоположительных при пробирочном тесте. Затем эти изоляты подвергали слепому скринингу на наличие продукции бактериального суперантигена путем иммунодиффузии с антисыворотками против известных стафилококковых и стрептококковых суперантигенов, как описано ранее. (Ли П.К. и Шливерет П.М.).
4. Серологический тест: Серологические тесты для выявления антител к Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO будут измеряться коммерческими наборами. Нейтрализующее антитело к энтеровирусу будет проводиться по стандартному протоколу теста на нейтрализацию на микротитровальных планшетах. Изолят EV71 TW/2272/98 амплифицировали и очищали в качестве антигена для m-захвата ELISA для обнаружения EV71 IgM. Если потенциальный возбудитель определен, дальнейшие серологические тесты на конкретный возбудитель будут проведены позже.
5. Статистический анализ. Данные были проанализированы с помощью статистического пакета SAS (версия 8.2, Институт SAS, Кэри, Северная Каролина). Мы использовали критерий Стьюдента для непрерывных переменных и критерий c 2 для категориальных данных. После того, как однофакторный анализ показал статистически значимые переменные, был выполнен прямой пошаговый множественный логистический регрессионный анализ для одновременной корректировки вмешивающихся факторов и для расчета многомерно скорректированных отношений шансов. Уровень выбора модели был установлен на уровне 0,15 для внутренних и внешних моделей. P <0,05 считалось статистически значимым.