Etiologistudie av Kawasakis sjukdom

Patienturval och familjeövervakning: På National Taiwan University Hospital i Taiwan kommer vi att studera patienter som uppfyller kriterierna för Kawasakis sjukdom eller atypisk Kawasakis sjukdom och deras familjemedlemmar i hushållet från 2004 till december 2005. Den institutionella granskningsnämndens godkännande kommer att erhållas för denna studie och informerat samtycke kommer att erhållas från alla försökspersoner eller deras föräldrar. Om patienter på akutmottagningen, polikliniken eller slutenvårdsavdelningen hade kliniska syndrom som tydde på EV71-infektion, ombads de och deras familjemedlemmar att delta i studien. Hals- och rektalprover för virusisolering och det första blodprovet. Kliniska manifestationer, förlopp och resultat registrerades. Om de patienter som misstänks för infektion vid något tillfälle uppvisade kliniska symtom, ombads de andra familjemedlemmarna i samma hushåll att genomgå screening genom virusisolering av svalgprover och fick det första blodprovet. Enkätbaserade intervjuer användes för att samla in information inklusive demografiska data, antalet sovrum i hushållet, kontakttid, mönster och förekomst av aktuella/nya tecken och symtom (hosta, rinorré, ont i halsen, hudutslag, feber, buksmärtor och diarré ) och föregående kontakthistorik med personer utanför hushållet som hade klinisk sjukdom. Uppföljande telefonintervjuer upprepade frågor om tecken och symtom med 2, 4 och 8 veckors intervall. Om någon familjemedlem i hushållet rapporterade att han upplevde tecken eller symtom som tyder på Kawasakis sjukdom under uppföljningsperioden, kommer hushållsmedlemmen att få ytterligare klinisk bedömning och upprepad laboratorieundersökning för Kawasakis sjukdom. Ett andra blodprov togs från KD-fallen och alla deras familjemedlemmar i hushållet 4 veckor efter det första blodprovet togs. Val av kontrollfall: En kontroll som matchar ålder och kön kommer att väljas slumpmässigt. Kontrollen blir de inlagda patienterna på samma avdelning som har andra diagnoser (som lunginflammation, UVI, tonsillit). De kommer också att få skärmen för virus- och bakterieupparbetning som hushållsmedlemmarna gör.

Definitioner av Kawasakis sjukdom och atypisk Kawasakis sjukdom:

1. Kriterier för Kawasakis sjukdom:

   • lika med eller över fem av följande: feber i mer än 5 dagar, icke-purulent konjunktivit, hudutslag, induration av handflatan/sula och erytem följt av avskalning, halslymfadenopati, jordgubbstunga eller läppfissur/blödning
2. Atypisk Kawasakis sjukdom; mindre än fem av ovanstående men med kransartäraneurysm.

Laboratoriemetoder

1. Virusisolering och serotypning:

   Halsprover, rektalprover eller avföringsprover lämnades in för virusisolering. Prover inokulerades i human embryonal fibroblast, LLC-MK2, HEp-2 och rabdomyosarcoma (RD) cellkulturer. När cytopatisk effekt involverade mer än 50 % av cellmonoskiktet, skrapades cellerna och utsattes för indirekt fluorescerande antikroppsfärgning med specifika antikroppar (Chemicon International Inc., Temecula, CA) eller typades med specifika metoder enligt de misstänkta typerna av virus.

2. Molekylär diagnos för virus eller andra patogener som är svåra att odla:

   1. Viral RNA- och RNA-extraktion: RNA- och DNA-extraktion kommer att utföras med hjälp av Isolation Kit enligt tillverkarens guide. (RNA-extraktionssats, Qiagen). 140 µL svalgpinne blandades med AVL-buffert i 10 till 15 minuter vid rumstemperatur. Snurra sedan ner blandningen. Tillsätt 560 uL 100 % alkohol i pelleten och inkubera i minst 10 minuter vid rumstemperatur. Blandningen kommer att placeras i centrifugeringskolonnen och centrifugeras vid 8000 rpm i 1 minut två gånger. Sedan tillsätts 500 ul AW1-buffert och blandningen centrifugeras vid 80 000 rpm under 1 minut, och sedan tillsätts 500 ul AW2-buffert och centrifugeras vid 14 000 rpm under 3 minuter. Kassera lösningen och centrifugera vid 14000 rpm i 2 minuter. Slutligen kommer 25 till 30 ul AVE-buffert att tillsättas och centrifugeras vid 8000 till 10000 rpm under 1 minut.
   2. Omvänd transkription: RT kommer att utföras med 1:a sträng cDNA Synthesis Kit för RT-PCR (Roche). Blanda det tidigare extraherade RNA:t med reagens inklusive buffert, MgCl2, dNTP, Oligo-p(dT)15-primer, RNas-hämmare, omvänt transkriptas, vortexa kort, inkubera reaktionen vid 25oC i 10 minuter och sedan 42oC i 60 minuter. Inkubera slutligen vid 99oC i 5 minuter och kyl sedan till 4oC i 5 minuter.
   3. TagMan PCR i realtid för enterovirus, adenovirus eller annan viral etiologi. Primrarna och sonderna för enterovirus och andra virus i realtid PCR finns i följande tabell. Primers och prober för PanEV valdes baserat på mycket konserverade regioner i den 5'-otranslaterade regionen av enterovirusgenomet. Primrarna och proberna för EV71 valdes baserat på de mest olika och specifika genetiska regionerna i VP1-regionen av enterovirusgenomet. Andra potentiella virus, såsom adenovirus, eller andra respiratoriska virus kommer också att utföras med PCR eller RT-PCR eller realtids-PCR enligt reglerna i ovanstående procedurer.
   4. Representativ differentialanalys följt av subtraktiv kloning
3. Bakteriekulturer och toxindetektering: Kulturer erhölls från svalget och ändtarmen från patienter med akut KD innan den intravenösa infusionen av immunglobulin påbörjades och från kontrollpatienter med användning av ett Baxter Diagnostics Culturette-system som innehåller en bomullspinne. Det primära datainsamlingsbladet fylldes i och förvarades på platsen där prover togs. Plattorna undersöktes sedan med avseende på alla â-hemolytiska grupp A streptokocker och alla S aureus som var koagulaspositiva genom rörtestet. Dessa isolat screenades sedan på ett förblindat sätt med avseende på närvaron av bakteriell superantigenproduktion genom immundiffusion med antisera mot kända stafylokock- och streptokocksuperantigener såsom beskrivits tidigare. (Lee PK och Schlieveret PM).
4. Serologiskt test: Serologiska tester för antikroppsdetektion av Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO kommer att mätas med kommersiella kit. Neutraliserande antikropp för enterovirus kommer att utföras enligt standardprotokollet för neutralisationstestet på mikrotiterplattor. EV71-isolat TW/2272/98 amplifierades och renades som ett antigen för m-infångnings-ELISA för EV71 IgM-detektion. Om potentiell patogen definieras kommer ytterligare serologitest för den specifika patogenen att göras senare.
5. Statistisk analys: Data analyserades med SAS Statistical Package (Version 8.2, SAS Institute, Cary, North Carolina). Vi använde Students t-test för kontinuerliga variabler och c 2-test för kategoriska data. Efter univariat analys screening statistiskt signifikanta variabler, framåt stegvis multipel logistisk regressionsanalys utfördes för att justera confounders samtidigt och för att beräkna multivariatjusterade oddskvoter. Nivån på modellvalet sattes till 0,15 för in- och utmodeller. P < 0,05 ansågs statistiskt signifikant.