Mutation av K-RAS, CDKN2A, SMAD4 och TP53 i pankreascancer: vätskebiopsis roll i preoperativ diagnos

BAKGRUND Bukspottkörtelcancer är den fjärde cancerrelaterade dödsorsaken i västländer och förväntas bli den andra vanligaste dödsorsaken år 2030 [1]. Ungefär 80 % av patienterna är icke-opererbara vid diagnos [2] inklusive 41,4 % av patienterna som inte är opererbara vid explorativ laparoskopi/tomy [3]. Dessutom kommer upp till 38% av slutligen resekerade patienter att behöva en vaskulär resektion för att uppnå en radikal pankreatektomi [4], varav drygt hälften på grund av en histologisk invasion [2]. Sist men inte minst kommer framgångsrikt resekerade patienter att återkomma inom 12 månader i mer än 40 % av fallen med dyster prognos [5]. Dessa tidiga återkommande patienter kommer att visa lokal spridning eller metastaserande sjukdom inom 12 månader med en överlevnad efter recidiv och total överlevnad mer än halverad jämfört med patienter som återkommer mer än ett år efter resektion [5]. Laparotomi kan därför vara värdelös hos sådana patienter. I denna miljö spelar neoadjuvant behandling en nyckelroll. Det har potentiella fördelar att leverera systemisk terapi till alla patienter med en ökad effekt av radio- och kemoterapier distribuerade i ett jungfruligt fält, identifiera patienter med aggressiv tumörbiologi som kan återkomma kort efter operationen och därmed inte skulle gynnas av en operation. Dessutom kan neoadjuvant terapi sänka tumören genom att undvika större kärlresektioner, minska resektioner med positiva marginaler och minska postoperativa bukspottkörtelfistel [6]. Tyvärr är avbildning inte längre tillförlitlig för att förutsäga resektabilitet efter neoadjuvant behandling [7]. Den totala genomsnittliga direkta kostnaden för en patient med en resecerbar sjukdom är $134 700, medan denna kostnad för metastaserade eller icke-opererbara patienter är $49 000-65 300 [8]. En korrekt iscensatt patient ger en bättre resursallokering.

Flytande biopsi ger en icke-invasiv signatur av tumören, den är baserad på cirkulerande genetiskt material som kommer från cellulär omsättning och därmed speciellt från tumören [9]. Analys av mutationer på cellfria nukleinsyror ger translationell information om tumörbiologi och därför om dess klinisk-patologiska egenskaper och sannolikt om dess progression. Progression av pankreascancer har länge studerats. Vad som är tydligt är att aktiverande K-RAS-mutationer är en tidig händelse i de flesta lesioner, följt av inaktiverande mutationer i CDKN2A, TP53 och SMAD4 [10]. Dessa 4 bergsgener förutsäger progressionsmönster i en autoptisk studie: patienter med 2 eller färre genmutationer var mer benägna att utveckla oligometastatisk misslyckande och att hysa tidigare sjukdomsstadium vid diagnos jämfört med de med 3 eller fler muterade gener [11]. K-RAS-mutationer har associerats med en sämre total överlevnad, särskilt när de hittas i perifert blod genom flytande biopsi [12]. CDKN2A-mutationer har associerats med lymfatisk invasion och utbredda metastaserande återfall [13]. TP53-mutationer har associerats med dålig differentiering och lokoregionalt återfall [13]. Slutligen har SMAD4-mutationer associerats med portalveninvasion, perineural invasion och lymfkärlinvasion [14]. Förutom bevis på dessa bergsgener finns det en växande mängd bevis för flera stadie- och prognosprediktorer: MET-protein överuttryck korrelerade signifikant med ökat TNM-stadium och försämrad överlevnad [15]; EDIL3-uttryck var signifikant uppreglerat i PDAC i både cellinjer och kliniska prover och korrelerade med patienternas TNM-stadium, T-klassificering och totala överlevnadstider [16]; BRCA1/BRCA2-mutation förutsäger betydligt kortare sjukdomsfri och total överlevnad [17]; Högt RAB27A-uttryck var signifikant associerat med vaskulär invasion och tumörstadium [18].

Dessa data har validerats på prover av tumören och därmed vanligtvis på prover eftersom endast 53,3% av ultraljudsstyrda biopsier ger tillräckligt med material för histopatologi och/eller immunhistokemi [19]. Nya bevis visar att bukspottkörtelcancer är en av de fyra cancerformerna, tillsammans med kolorektal, gastroesofageal och bröstcancer, där detekterbara ctDNA-nivåer är närvarande antingen i lokaliserade antingen i metastaserande stadier [20]. Som sett i tidigare studier är överensstämmelsen mellan plasma och primära tumörmutationer så hög som 100% vid pankreascancer [9, 21].

Studiet av dessa mutationer på flytande biopsi skulle ge icke-invasiv information om preoperativ stadieindelning och mönsterprogression och därför en mer exakt terapeutisk planering.

SYFTE MED PROJEKTET Denna studie är en pilotstudie. Genomiska data kommer att beskrivas tillsammans med de kliniska egenskaperna hos sjukdomen för varje patient.

Det primära syftet med denna studie är att utvärdera förhållandet mellan mutationer av de huvudsakliga generna som är ansvariga för progression av pankreascancer (K-RAS, CDKN2A, SMAD4 och TP53) tillsammans med andra relaterade till stadium och prognos (MET, BRCA1/BRCA2, EDIL3 och RAB27A) upptäckt på perifert blod och tid till progression och vaskulär invasion hos patienter som genomgår pankreatektomi. Andra resultat av intresse kommer att vara klinisk patologiska och operativa egenskaper såsom operationstid, typ av vaskulär resektion, kliniskt stadium, patologiskt T-, N- och M-stadium, marginalstatus och total överlevnad.

MATERIAL OCH METOD Patienter med icke-metastaserande PaC som genomgår bukspottkörtelresektion kommer att registreras från operationsavdelningar på en multicenter internationell webb. Blodprover i EDTA kommer att centrifugeras vid 2300 rpm i 10 minuter två gånger. Flytande biopsier kommer att samlas in preoperativt och förvaras vid -80°. En skyddad anonym multiparametrisk databas kommer att fyllas med all relevant patient- och sjukdomsinformation (sex, födelsedatum, komorbiditeter, BMI, laboratorietester, kliniskt skede, operationstid, operationstyp, ICU-vistelse, Dindo-Clavien postoperativ sjuklighet, patologiskt stadium, TNM, Gradering, ajcc 8:e stadium, perineural, vaskulär och lymfatisk invasion, resektionsmarginaler, sjukdomsfri överlevnad, total överlevnad) och K-RAS, CDKN2A, SMAD4, TP53, MET, BRCA1/BRCA2, RAB27A och EDIL3 somatisk genetisk mutationer på flytande biopsi med Next Generation Sequencing (NGS).

Rekryteringen kommer att vara multicentrisk: AOU sant'andrea di Roma, Policlinico Universitario Gemelli di Roma, St Vincent University Hospital Dublino, Policlinico Universitario di Modena.

STATISTISK ANALYS Bedömning av samband mellan genmutationer och vaskulär invasion kommer att utföras med hjälp av logistiska regressionsmodeller. En övergripande poäng kommer att utarbetas baserat på avrundning av uppskattade log-oddskvoter och dess prestanda utvärderad med hjälp av ROC-kurvor och C-statistik.

En utvärdering av den villkorliga associationen kommer också att utföras med hjälp av multivariabla logistiska regressionsmodeller, vilka kommer att väljas genom att minimera Akaike Informationskriteriet.

För att bedöma sekundära resultat kommer vi också att använda Cox regressionsmodeller på liknande sätt.

Så vitt vi vet finns det information i litteraturen om frekvensen av vaskulär invasion vid pankreatektomier med vaskulär resektion (56,7 %), och om mutationer av generna av intresse i pankreas duktalt adenokarcinom (den lägsta muterade allelfrekvensen är 30 % för CDKN2A). Eftersom det inte finns någon tidigare hypotes om sambandet mellan gener och vaskulär invasion, och eftersom denna studie helt enkelt involverar analys av en liten mängd blod som inte utgör någon ytterligare risk för patienten, bestämde vi oss för att utföra en pilotstudie baserad på 50 patienter. En fullt planerad och tillräckligt driven studie kommer sedan att genomföras på grundval av resultaten från denna pilotstudie. Provstorleken på 50 bedöms tillräckligt liten (med tanke på, som sagt, ingen ytterligare risk och ingen användning av invasiva tekniker) men tillräckligt stor för att garantera att den slutliga beredskapstabellen inte är sparsam. Alla analyser kommer att utföras med programvaran R.

SLUTSATSER Icke-metastaserande PaC representerar en utmaning vid stadieindelning och prognosdefinition. En patientanpassad behandling kräver en noggrann preoperativ stadieindelning. Hittills lämnar mer än 40 % av patienterna som ansetts vara resekterade operationssalen oopererade och ytterligare 40 % av de resekerade patienterna återkommer inom ett år. Bland patienter som erbjuds en operation skulle vissa ha nytta av en neoadjuvant behandling och andra av palliativa behandlingar. Det är därför en tillförlitlig preoperativ stadieindelning är avgörande vid terapeutiskt beslutsfattande. Invasiva diagnostiska tester av bukspottkörteln är dyra och riskabla på grund av dess centrala retroperitoneala läge. Vätskebiopsi erbjuder en icke-invasiv tumörkarakterisering. Denna studie kommer att vara den första som analyserar förhållandet mellan de fyra stora generna, tillsammans med 5 andra prognostiska gener, involverade i bukspottkörtelcancers uppkomst och progression och T-stadiet med särskild uppmärksamhet på tidigt återfall och vaskulär invasion, genom flytande biopsi. Detta kommer att resultera i en bättre resursallokering, behandlingsplanering och patientresultat.

REFERENSER

1. Cancer Res. 2014; 74: 2913-2921
2. Ann Surg Oncol. 2016 Jun;23(6):2028-37
3. Cochrane Database Syst Rev. 2016 Jul 6;7:CD009323
4. J Gastrointest Surg 2004 Dec;8(8):935-49
5. Ann Surg 2018 23 mars Epub före tryck.
6. J Gastrointest Oncol. 2015 aug;6(4):418-29.
7. Ann Surg. 2017 7 dec. doi: 10.1097/SLA.00000000000002600. [Epub före tryckning]
8. Cancer. 2012 15 okt;118(20):5132-9
9. Science 2018 feb 23:359(6378):926-930.
10. Onkogen. 2013 nov 7;32(45):5253-60.
11. Clin Cancer Res 2012 Nov 15;18(22):6229-47.
12. Kräftan 2015 1 jul;121(13):2271-80.
13. Ann Surg 2013 aug;258(2):336-46.
14. Pankreas 2015 maj;44(4):660-4.
15. World J Gastroenterol 2014 Jul 14;20(26):8458-70.
16. Oncotarget 2016 Jan 26;7(4):4226-40.
17. J Am Coll Surg 2018 apr;226(4):630-637.
18. Med Oncol (2015) 32:372.
19. Gastrointest Endosc. 2016 okt;84(4):670-8.
20. Sci Transl Med 2014 19 feb;6(224):224ra24.
21. Proc Natl Acad Sci U S A 2017 Sep 19;114(38):10202-10207.