IAAO を使用したクローン病の成人男性におけるスレオニン要件

背景 必須アミノ酸の必要量に関する現在の食事基準摂取量 (DRI) の推奨事項は、健康な若年成人向けの推奨事項に基づいており、クローン病患者では直接決定されていません。 タンパク質とアミノ酸は、私たちの食事の重要な構成要素です。 IAAO を使用して健康な成人の必須アミノ酸、スレオニンの要件を定義したことで、研究者は現在、クローン病 (CD) などの慢性炎症状態の患者など、脆弱な集団のニーズを定義する理想的な立場にあります。

動物での研究は、クローン病および大腸炎モデルにおけるスレオニン要求の増加を示唆しています. これが人間にも当てはまる場合、IBD患者のスレオニン必要量に関する知識は、この患者集団の医学的栄養管理を改善するための貴重な情報を提供する可能性があります. 改善された医療栄養療法は、IBD 患者の回復時間を短縮したり、寛解期間を延長したりする可能性があります。

方法：

インジケーター アミノ酸酸化

仮説：

CD 患者のスレオニン必要量は、IAAO 法を使用して以前に決定された若年成人のトレオニン必要量 (19 mg/kg/日) よりも高いと仮定されています。

目的:

1. IAAO 法を使用して、CD 患者のスレオニンの必要量を決定する。段階的なロイシン摂取に応じた L-[1-13 C] フェニルアラニンの 13 CO 2 [F 13 CO 2] への酸化を測定します。
2. 体重と無脂肪量に基づいて、この研究から導き出された必要量を、以前にIAAO法によって若年成人で決定されたスレオニンの必要量と比較する.

科目：

臨床的に安定した最大 10 人の CD 患者が、トロントの Mt. Sinai 病院の IBD クリニックから募集され、この研究のために Mark Silverberg 博士によって特定され、その後 The Hospital の Clinical Research Center (CRC) でフォローアップされます。病気の子供 (SickKids)、トロント、カナダ。 研究が始まる前に、参加者は、身長、体重、体脂肪量、除脂肪量、安静時代謝率、および医療に関する研究前の評価のために、CRC（ルーム 5500 ヒル ウィング、病気の子供のための病院）を訪問する必要があります。歴史。 これらの評価は、完了するまでに約 3 時間かかります。 彼らは、研究前の評価の前に10時間絶食している必要があります。 研究に必要な食事量を計算し、健康状態を評価するために、研究前の評価が必要です。

同意書に署名した後、被験者はスクリーニング手順（身長、体重、空腹時血液サンプルと病歴アンケート、BIA、スキンフォールド、および熱量測定）を完了します。

• ボランティアは、研究に参加している間に発生した費用に対する金銭的補償を受け取ります。
• 研究のすべての手順は、SickKids の研究倫理委員会によって承認されます。

実験計画：

実験計画は、調査日中に血液ではなく、呼吸と尿を収集するための低侵襲 IAAO モデルに基づいて行われます。 CD患者におけるスレオニンの必要量を決定するために、最大合計50のIAAO研究が実施されます。 CDを有する最大10人の男性患者が募集されます。 各被験者は、少なくとも 2 つの摂取レベル、最大 5 つの異なるスレオニン摂取レベルについて研究されます。 摂取量の各レベルは、被験者にランダムに割り当てられます。

研究前の評価では、被験者の安静時エネルギー消費量（REE）が連続的な開回路間接熱量測定によって測定され、体組成が皮下脂肪厚および生体電気インピーダンス分析（BIA）によって測定されます。 被験者はまた、研究前の評価時および各IAAO研究日の開始時に体重を測定して、食事と同位体の正確な処方を確実にし、研究全体で体重の維持を確認します。

各研究は、被験者のエネルギー要件に応じて処方された食事への2日間の適応期間と1研究日で構成されます。 食事は、1 g プロテイン×kg-1×d-1 の十分な量のタンパク質を提供します。 2 日間の適応期間は、体が十分な量のタンパク質に適応できるようにするためのものです。これは、タンパク質がないとタンパク質の動態が変化することが示されているためです。 2 日間の適応に続いて、スレオニン摂取量がランダムに割り当てられ、L-[1-13C]Phe を使用してフェニルアラニン (Phe) 動態が測定される研究日です。 この日、VCO2 は 5 回目の食事の直後に熱量計で 20 分間測定されます。

食事摂取量と実験食:

3日間のプロトコル

• 1 日目と 2 日目に、被験者は適応食を摂取し、3 日目に 8 時間の試験期間に参加します。 各 3 日間のプロトコルは、少なくとも 1 週間 (ウォッシュ アウト期間) で区切られます。
• 3日目のIAAO研究の前の2日間の適応期間中の食事摂取量は、被験者の要件を満たすために、炭水化物（SolCarb）とタンパク質（ベネプロテイン）を加えたラクトースフリーのミルクシェイク（Scandishake）の形で提供されます。 タンパク質はスカンディシェイクから乳タンパク質（カゼインとホエー）として提供され、1g.kg-1.day-1を提供します プロテイン摂取。 総カロリーは、間接熱量測定による安静時エネルギー消費量 (REE) 測定値として提供され、1.7 を掛けます。 順応日には、4 つの等窒素、等カロリーの食事が 1 日を通して均等に提供されます。
• 研究日（各 3 日間の 3 日目）に、食事は、アミノ酸動態研究で使用するために開発された風味のある液体調合物とタンパク質を含まないクッキーで構成される 8 時間ごとの等カロリー、等窒素食として提供されます。 各食事は、被験者の 1 日総必要量の 1/12 に相当します。 食事の窒素 (タンパク質) 含有量は、卵タンパク質のアミノ酸組成に基づく結晶性アミノ酸混合物の形で提供されます。 研究日のエネルギー摂取量は REE x 1.5 として提供されます。
• チロシンは 40 mg/kg/日で過剰に提供されます
• フェニルアラニンは、20mg/kg/日の一定摂取量で提供されます。
• スレオニンは 3 ～ 45 mg/kg/日の段階的な摂取量で提供され、アラニン レベルは変化するロイシン レベルのバランスを取り、式が等窒素になるように調整されます。
• 研究期間中、毎日のマルチビタミンサプリメントが提供されます。
• 適応日には、水、透明なお茶 1 杯、または透明なコーヒー 1 杯を除いて、他の食べ物や飲み物は消費されません。
• 8 時間の試験日の間、水以外の飲食物は一切摂取しないでください。

勉強の日

• 研究日の食事は、8つの等窒素、等カロリーの食事に分けられ、それぞれが被験者の1日の総必要量の12分の1に相当します。
• 各研究日の朝、被験者は自宅で毎時 4 食を摂取し、その後研究所を訪れます。 その後、被験者は 8 つの等カロリー食のうち残りの 4 つを 1 時間間隔で消費し始めます。
• 「実験計画」で述べたように、最大​​ 5 つの食事性スレオニン摂取レベルがランダムな順序でテストされます。
• 1-13C フェニルアラニンは、5 回目の食事でトレーサーとして与えられ、残りの食事で引き続き投与されます。

体組成測定

• 体組成は、生体電気インピーダンス分析 (BIA および研究開始時の研究前評価中の複数回の皮膚の厚さの測定) によって決定されます。 脂肪量の推定値を得るために、4 つの皮下脂肪の厚さ (上腕三頭筋、上腕二頭筋、肩甲骨下、および上腕骨) が測定されます。 BIA は、固定周波数アナライザー (50 kHz; BIA モデル 101A: RJL Systems) を使用して実行されます。 FFM の計算には、前述の式が使用されます。

同位体注入プロトコル:

• 1-13C フェニルアラニンが同位体として使用されます。 0.66 mg/kg の経口プライミング用量が 5 回目の食事で投与され、1.2 mg/kg/d の 1 時間ごとの経口用量が同時に開始され、食事 6、7、および 8 で 3 時間継続されます。 呼吸中のバックグラウンドの 13CO2 が平衡に達するように、合計 4 回の同位体投与が行われます。
• L-[13C]phe のプライミング用量が投与されると同時に、0.176 mg/kg の重炭酸塩 (NaH13CO3) の経口プライミング用量も投与されます。
• 研究日に同位体として与えられたフェニルアラニンの量は、総食事摂取量を20 mg Phe / kg / dに維持するために、食事のフェニルアラニンから差し引かれます
• チロシンの過剰摂取を確実にするために、チロシンの摂取量は 40 mg·kg-1·d-1 に維持されます。
• トレーサーが消費される前後に、呼気と尿のサンプルが定期的に収集されます。

サンプル コレクション:

• 尿と呼気のサンプルは、ベースラインと同位体の定常状態で収集されます。
• 呼気サンプルは、尿サンプルと同時に収集されます。
• 5 つのベースライン呼気サンプルは、60、45、30、15 分、およびトレーサー プロトコルが開始する直前に収集されます。
• 3 つのベースライン尿サンプルは、60 分、30 分、およびトレーサー プロトコルが始まる直前に収集されます。
• トレーサープロトコルが開始されてから 2.5 時間後に、15 分ごとに 4 つのプラトー呼気サンプルが収集されます。
• トレーサ プロトコルの開始後 2.5 時間に、30 分ごとに 3 つのプラトー呼気サンプルを収集します。
• Exetainers プラスチックチューブに息を吹き込んだ被験者から呼気サンプルを採取し、分析まで室温で事前に排気したガラスチューブにサンプルを保存します。
• 尿サンプルをエッペンドルフチューブに採取し、1-13C フェニルアラニン濃縮について分析するまで -20 ºC で保存します。
• CO2 生成率 (VCO2) は、呼吸中の 13CO2 排泄を定量化するために、食事 5 で換気フード間接熱量計を使用して各試験日に測定されます。

サンプル分析。

• 息: 期限切れの 13 CO2 濃縮は、連続フロー同位体比質量分析計 (IRMS) によって測定されます。
• 尿中の 1-13C フェニルアラニンの濃縮は、ガスクロマトグラフィータンデム質量分析 (LC-MS-MS) によって分析されます。

同位体動力学の推定 全身フェニルアラニンフラックスは、Matthews et al.の確率モデルに従って、前述のように計算されます。 ベースラインとプラトーでのトレーサー濃縮における同位体定常状態は、尿中の L-[1-13C] フェニルアラニンと呼気中の 13CO2 の不変の値として表されます。

フェニルアラニンフラックス (umol/kg/h) は、尿中の 13C-フェニルアラニンの濃縮を使用して、代謝プール (定常状態) への経口投与された 13C-フェニルアラニンの希釈から計算されます。 摂取された 13C-フェニルアラニンの酸化後の呼気中の 13CO2 の出現率 (F13CO2 umol/kg/h) は、Matthews らのモデルに従って計算されます。体の重炭酸塩プール。 フェニルアラニンの酸化速度 (umol/kg/h) は、F13CO2 と尿中の 13C-フェニルアラニン濃縮度から計算されます。

統計分析

対応のある t 検定を使用して、以下をテストします。FFM と体脂肪率の違い。 BIAとスキンフォールドの2つの体組成法の違い。 ANOVA を使用して、体組成 (脂肪と FFM) のさまざまな推定値の違いをテストし、関連性をテストするために相関分析を実行します。

トレオニンの摂取量は被験者内で完全に無作為化され、トレオニンの摂取量が主な治療効果となります。 フェニルアラニン フラックス、酸化、および F13CO2 に対するスレオニンの効果は、SAS を使用して確率変数として被験者を使用した混合線形モデル (PROC MIXED) を使用してテストされます。 個々のフラックス間の差異は、ANOVA によって比較され、Bonferroni 多重比較検定を使用した事後分析が行われます。

スレオニン必要量は、二相性線形回帰クロスオーバー分析を適用してブレークポイント (EAR) を決定し、その後 95% CI を計算することによって決定されます。 平均スレオニン必要量は、非線形混合効果モデル (PROC NLMIXED; SAS Institute) を酸化および F13CO2 データに適用することによって推定されます。 被験者内の観察は、統計的に依存していると見なされます。