牛乳铁蛋白作为长时间机械通气患者消化道选择性去污的天然方案 (LFasSDD)

背景 院内感染 院内感染，尤其是对抗生素耐药的细菌引起的感染，是重症监护医学面临的主要威胁。 一项系统评价显示，接受机械通气 (MV) 超过 48 小时的患者中有 10-20% 会发生呼吸机相关性肺炎 (VAP)，发生 VAP 的患者死亡的可能性是未发生 VAP 的类似患者的两倍，而患者发生 VAP 的患者的额外住院费用超过 10,019 美元 [1]。

同样的问题也发生在台湾的呼吸护理中心 (RCC)，这些中心旨在护理长期机械通气 (PMV) 超过 21 天的患者。 来自台湾的一份报告显示，RCC 的院内感染率约为 40%，发生院内感染的患者与未发生感染的患者相比，脱机率较低，病死率较高 [2]。 据估计，美国每年发生的院内感染中有 50% 至 60% 是由抗生素耐药菌株引起的 [3]。 这种高耐药菌株率增加了感染的发病率、死亡率和医疗费用。 预防感染和限制抗生素耐药菌株的出现是重症监护医学中的两个重要问题。

消化道选择性去污（SDD） 目前关于院内感染的假设之一是鼻咽和口咽部的定植使患者易患院内肺炎，肠道细菌过度生长增加肠壁通透性，导致细菌移位和败血症。 消化道选择性净化 (SDD) 旨在消除口咽和胃肠道潜在病原体的定植，是减少危重患者呼吸机相关性肺炎 (VAP) 和败血症的策略之一。 关于 SDD 在降低死亡率和预防抗生素耐药性方面的有效性存在争议 [4-6]。 目前的 SDD 方案可能会产生选择性压力并诱导耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)、含有超广谱 β-内酰胺酶 (ESBL) 的革兰氏阴性杆菌甚至念珠菌的出现 [7, 8]。 因此，SDD 研究必须旨在找到一种对大多数病原体有效的理想方案，同时保持厌氧菌群不受干扰。

乳铁蛋白 乳铁蛋白 (LF) 是一种铁结合糖蛋白，存在于乳汁和各种外分泌物，如唾液、眼泪、气道分泌物和中性粒细胞颗粒中，表明在先天免疫中具有重要作用。 这种蛋白质具有许多生物学功能，包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化和免疫调节作用。 胃蛋白酶对 LF 的部分降解可能会产生具有更强抗菌活性的称为乳铁蛋白的肽。 在体外和体内研究中，LF 和乳铁蛋白已被证明可以抑制许多病原菌的生长，包括抗生素耐药菌株、真菌甚至病毒 [9,10]。 在小鼠实验中，牛 LF 的口服给药减少了胃肠道中的细菌感染 [9]，同时促进了低铁需求细菌的生长，例如乳杆菌和双歧杆菌，这些细菌通常被认为对宿主有益 [11]。

牛乳铁蛋白 (bLF) 与人乳铁蛋白 (hLF) 具有高 (77%) 氨基酸同源性，bLF 在体外表现出比 hLF 更高的抗菌活性。 5 牛乳铁蛋白已获得美国 GRAS（公认安全）地位食品和药物管理局 [12] 并在此基础上将其添加到许多制造商的婴儿配方奶粉中，没有报告不良反应。 尽管有许多有希望的体外和动物实验数据，但关于 bLF 的临床信息很少，没有研究调查 bLF 补充剂对长期机械通气患者的影响。

我们之前的研究 我们之前证明，由酵母 [13] 产生的重组猪 LF (pLF) 和合成的 20 残基猪乳铁蛋白肽 [11] 在体外均表现出抗菌活性。 其杀菌活性是人乳铁蛋白的四倍 [14]。

在我们最近的报告 [15] 中，我们对转基因牛奶喂养动物模型的消化道进行了病原体挑战，以测试猪 LF (pLF) 是否是一种有效的 SDD 方案。 转基因小鼠在哺乳期以 120 ± 13.6 mg/L 的乳汁表达重组 LF，并喂养正常 CD-1 小鼠幼崽 4 周。 这些幼崽随后受到致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的攻击。 与喂食正常牛奶的对照组相比，喂食 pLF 转基因牛奶的组在体重增加方面表现出统计学上的显着改善，肠液、血液和肝脏中的细菌数量减少，小肠组织中的微绒毛更健康，促炎细胞因子更低. 结果表明，在转基因小鼠的乳汁中表达重组 pLF 并将其喂给小鼠幼崽会在消化道中产生广谱抗菌活性，并保护小肠粘膜免受损伤，这意味着猪 LF 可用作有效的选择性去污剂的消化道。

本研究的目的 本研究是一项前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照的临床试验，旨在检验口服 bLF 补充剂是否能降低长期机械通气患者的院内感染、败血症甚至死亡率。

方法 患者 2010 年 7 月 1 日至 2012 年 6 月 30 日，我们将招募约 280 名机械通气超过 21 天且入院时无明显感染迹象的患者进行临床研究。 该研究已送交中国医科大学附属医院伦理委员会审批。 经我们解释后，患者或监护人提供书面知情同意书。 排除标准是缺乏/拒绝知情同意、持续的抗生素治疗感染、预计 7 天内的死亡率。 所有患者都将接受随访，直至死亡或出院。

目标 主要目标是评估 bLF 在预防 RCC 入院后首次院内感染和细菌或真菌源性败血症方面的有效性。 次要目标是评估肺炎、尿路感染和败血症的发生率、出院前死亡率（总体和败血症归因）、MV 断奶率、MV 总天数、免疫系统改变、细胞因子和肝功能，以及不良反应影响或不耐受。

研究设计 乳铁蛋白和安慰剂在工厂中将被伪装成药物 A 和 B。 随机化将按中心分层，在获得知情同意后，患者将通过随机数字表序列随机分为 A 组或 B 组。 在研究期间，RCC 的任何患者、研究护士、研究人员或其他医务人员都不会知道这项任务。

患者将接受 bLF（10 mg/Kg/天）（Westland Co-operative Dairy Company，新西兰）或安慰剂（淀粉）作为对照。 bLF 的剂量是基于极低体重新生儿在出生后前 2 周内通过母亲新鲜乳汁摄入的平均 hLF 摄入量 (30-150 mg/d) [16] 并且发现 bLF 200 mg bid 是有效的抑制幽门螺杆菌 [17]。 药物管理将在 RCC 入院后 24 小时内开始，持续 6 周或直至出院。 药物和营养支持将被规定为医疗程序。

将通过日常检查对不良事件（例如，呕吐、喂养不耐受、皮疹）进行系统监测。 将每周监测肝功能、全血细胞计数、CD4/CD8、细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-12、IL-18）[18,19]。

结果的定义 脓毒症的诊断基于主治医师对临床体征和症状的检测、存在与脓毒症一致的实验室检查结果以及从血液或体液中分离出致病微生物。 脓毒症发作的患者继续接受随访，直至死亡或从 RCC 出院以获得次要结局 [16]。 VAP 的特征是存在呼吸道感染迹象（发热、白细胞增多和脓性呼吸道分泌物），以及在接受 MV 的患者的胸部 X 光片上出现新的持续浸润 [20]。 通过从耻骨上穿刺或膀胱插管收集的尿液中分离出病原体来诊断尿路感染，病原体生长超过 100 000 个细菌/mL 或超过 10 000 个真菌/mL。 MV 断奶成功定义为超过 5 天不需要 MV。

统计分析 样本量分析预测，每组总共需要 131 名 MV 患者才能检测到治疗和未治疗患者之间至少 60%（从 20% 降至 6%）的死亡率相对差异，基于双侧检验，I 类误差为 0.05 或更小，80% 功效为 80%。 定量变量将表示为平均值和标准偏差。 分类变量将以百分比表示。 使用 Fisher 对二分变量的精确检验和对连续变量的 Student's t 检验进行探索个体风险因素与主要/次要结果之间关联的单变量分析。 执行多变量逻辑回归模型以研究相关风险因素的影响和各种风险因素的相对贡献。 通过拟合模型的对数似然评估拟合优度。 在逻辑回归模型中计算比值比及其 95% 置信区间，以描述分类风险因素与结果之间关系的强度。 所有测试都是双侧的，p 值为 0.05 被认为具有统计显着性。 所有分析均使用 SAS 软件版本 6.12（SAS Institute Inc, Cary, NC）进行。

预期结果

我们的研究结果有望回答以下问题：

1. 口服补充 bLF 能否预防 PMV 患者的院内感染？
2. 口服补充bLF能否降低PMV患者院内感染的发生率，减少抗生素的使用？
3. 口服补充bLF能否降低PMV患者的死亡率？
4. 口服补充 bLF 能否提高 PMV 患者的 MV 脱机率？
5. PMV患者口服bLF后免疫系统有何变化？

当前项目的预期贡献 预防感染和限制抗生素耐药菌株的出现是重症监护医学中的两个重要问题。 寻找一种天然抗菌肽作为抗菌药物的辅助疗法治疗耐药菌株，或作为增强免疫力和预防感染的药物是研究的方向之一。 LF 是许多体外和动物研究中有前途的药物之一。 该研究试图检查 LF 是否是一种理想的自然 SDD 方案，用于预防 PMV 患者的院内肺炎或败血症。 如果结果为阳性，LF 可用于临床，以提高危重患者的生存率，提高 MV 撤机率，减少抗生素处方，最终降低医疗成本。

参考资料（没有 PMID 号的列表）

12. CFSAN/食品添加剂安全办公室。 机构回复函：GRAS 通知编号 GRN 000077。 美国食品和药物管理局网站。 http://www.fda.gov/Food/FoodIngredientsPackaging/GenerallyRecognizedasSafeGRAS/GRASListings/ucm154188.htm。 2001 年 8 月 14 日。 2009 年 5 月 21 日访问。