青春期前男孩的生育力保存：一种实验方法

随着儿科恶性肿瘤治疗方案的改进，越来越多的幸存者进入育龄期。 由于性腺损伤是用于治疗小儿癌症以及某些血液病和免疫缺陷的治疗的相对常见和不幸的后果，因此维持生育能力对于这些幸存者的长期生活质量极为重要。 必须考虑孩子的生育能力是否可能受到其治疗的影响。 理想情况下，这应该发生在治疗开始之前，此时可能存在保留患者未来生殖潜能的机会之窗。 精子库和生殖技术领域的发展使得为接受癌症治疗的青春期男性保持生育能力提供了可行的选择。 青春期男性可以在开始性腺毒性治疗之前制作精液样本，并将精子冷冻保存以备将来使用。 因为目前的卵母细胞受精方法可以使用少至一个活动精子，所以即使冷冻的精子数量很少，这种方法也被证明是成功的。 不幸的是，青春期前的男性对生育能力的保存提出了特殊的挑战。 这些男孩无法通过手淫产生用于冷冻保存的精液。 他们也没有成熟的精子。 虽然青春期前的睾丸不产生成熟的精子，但它确实含有二倍体干生殖细胞，单倍体精子将从中产生。 对于这些处于危险中的青春期前男孩，以及可能无法建立精子库的青春期男孩，最近一种令人鼓舞的方法是使用冷冻保存的睾丸组织。 虽然这一领域的动物研究取得了重要进展，但在人体中使用睾丸组织冷冻保存仍处于试验阶段。 如果可以在开始性腺毒性治疗之前获取并储存青春期前的睾丸组织，然后可以解冻该组织并将储存的生殖细胞重新植入患者自己的睾丸中，这一过程称为生殖细胞移植。 或者，储存的细胞可以在体外成熟，直到它们可以通过使用胞浆内单精子注射 (ICSI) 实现受精。

动物模型研究表明，有几种方法可以利用生殖细胞获得成熟精子进行受精，包括自体移植和异种移植。 自体移植被认为比异种移植更容易接受，尽管两者都在小鼠模型中取得了成功。 在啮齿动物中，自体移植导致精子发生恢复，小鼠在体内繁殖。 研究人员已经证明，将生殖细胞的粗悬浮液显微注射到不育的小鼠体内可以恢复精子发生和生育能力。 在大鼠和大型哺乳动物中也报道了类似的成功。 冷冻保存的细胞也可以恢复精子发生。 据估计，70%的精原细胞经冻融后仍能存活。 恶性污染仍然是围绕移植的主要关注点之一，尽管解决这个问题的少数研究在他们的发现中存在争议。 在解决这个问题方面已经在小鼠模型中取得了进展，特别是使用荧光激活细胞分选法从细胞悬液中对恶性细胞进行负分选。

由于 SSCs 的冷冻保存和移植目前在动物身上取得了成功，因此在不久的将来可能会应用于人类。 不孕症的可能性是许多家庭需要解决的问题，因为他们同意对儿子进行化疗。 由于此方法需要睾丸活检，因此父母的意愿和 SSC 收集的可接受性对于评估都很重要。 最近，研究人员采访了 318 位家长，询问他们对这种想法的接受程度。 他们要求父母假设性地思考以下场景，“如果在诊断时有可用的实验程序，您会让您的儿子接受睾丸活检以尝试收集 SSCs 吗？” 在诊断时，61% 的这些父母理论上认可通过睾丸活检收集 SSC。 他们还观察到，冷冻保存 SSCs 的愿望与肿瘤治疗的潜在危害无关，这表明即使是很小的不孕机会也被认为是对最终生活质量的主要负担。 这些数据表明，青春期前癌症男孩的父母希望将当前关于 SSC 收集和移植的动物实验转化为临床护理。

这是一种新颖的实验方案，需要临床医生和基础科学家之间的合作。 有几个关键的临床和转化点必须考虑，包括父母和青春期前患有癌症的男孩的信念和担忧，充分进行睾丸活检而不会产生负面后遗症的能力，以及用于生育和研究目的的组织储存，尤其是用于下游体外和功能基因组学研究的活检样本的可行性。

本提案的目标是开发临床、转化和基础科学计划，这将允许一个广泛的、专门的计划，用于从 Hadassah 医疗中心以及以色列的合作机构看到的青春期前男性的睾丸组织的采集和储存和世界各地。 开发用于组织分配和处理以及长期组织储存的方法是关键组成部分，特别是因为睾丸组织在用于生育环境之前可能需要储存数十年。 最重要的是，必须从头开发人类睾丸组织的冷冻保存方案，以最终成为青春期前患有癌症的男性以及将接受干细胞移植的患有血液病或免疫缺陷的男性的生育能力保存的标准选择.

开放式睾丸活检将由主治泌尿科医生进行（当患者因其他目的而全身麻醉时，将努力在手术过程中同时进行该手术，例如中心线放置、骨髓抽吸/活组织检查）。 该程序将在开始任何性腺毒性治疗之前进行。 然而，在紧急化疗的情况下，由于睾丸干细胞的毒性尚不清楚，因此可以在化疗后进行手术。 在睾丸的上极做一个 10 毫米的切口，并切除约 5% 的挤出曲细精管（约 2 毫米 x 4 毫米 x 10 毫米；约 1 克组织）。 这是出于临床原因（例如癌症评估）而进行的正常睾丸活检的大小。 对于婴儿或非常年幼的男孩，切口和活检的大小由泌尿科医师决定。

睾丸活检标本将立即在手术台上分开。 三分之二的标本（称为标本 #1）将冷冻保存在精子清洗培养基中，以供患者日后使用。 目前针对成人睾丸组织冷冻保存的冷冻方案（缓慢冷冻）将针对当前提案实施，并已在文献中发表用于青春期前睾丸组织。 具体而言，使用 0.7 M 二甲亚砜 (DMSO) 作为冷冻保护剂。 活检标本 #1 将附有患者姓名、出生日期、当前日期和医疗记录编号。 一份单独的表格也将与样本一起发送，其中包括电话号码和当前地址。 这些标本将留在哈大沙医疗中心的精子库中。

如上所述，另外三分之一的标本将用于研究目的，以努力推进分离和培养人类 SSC 以进行生育研究的科学。 这些部分将在划分时去除所有个人健康标识符，并分配一个唯一的识别代码。

本研究的风险与睾丸活检有关。 这个过程的副作用是轻微的。 与手术相关的疼痛是预料之中的，并且可以通过轻度至中度镇痛药物轻松控制。

好处是患者可能能够使用冷冻的睾丸活检组织和/或从活检中提取的培养的 SSC，以在未来保留他们的生育能力。 然而，此时必须注意，此过程纯粹是实验性的。 本研究的时间范围定义为从招募日期到临床利用冷冻保存组织恢复生育能力的日期，最长四十年。

我们将收集睾丸活检期间（术中）或之后发生的任何不良后果，包括疼痛、出血和/或感染。 事件将在手术后一周内被跟踪和记录，这个时间范围远远超过与此类活检相关的 2-3 天恢复时间。 不会收集/报告与受试者的癌症或癌症治疗明显相关但与睾丸活检无关的事件。