间充质干细胞外泌体治疗 COVID-19 的安全性和有效性的临床研究。

背景 1.1。 新型冠状病毒感染和当前医疗策略 由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 引起的 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 已肆虐三年多，在全球造成超过 500 万人死亡。 世界卫生组织已宣布 COVID-19 肺炎为全球大流行病和突发公共卫生事件[1]。 虽然诊断效率和治疗准确率有所提高，但总体治疗效果仍然有限。 死亡的主要原因包括重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、肺水肿或多器官功能衰竭[2]。 其中以ARDS最为严重。 病理学研究表明，ARDS的发病机制主要是由于冠状病毒攻击肺泡细胞引起的免疫反应；免疫细胞浸润导致肺毛细血管内皮结构破坏，使血浆、血浆蛋白和血细胞进入肺间质和肺泡腔，形成肺水肿。 由于肺泡上皮组织破坏，大量水肿液进入肺泡，导致肺泡弥散功能受限，不能进行正常的呼吸功能。 同时，随着组织损伤的加重，细胞进一步释放各种炎症因子，形成所谓的细胞因子风暴，最终彻底破坏大部分肺泡和支气管呼吸结构，造成严重的通气-灌注失衡，最终死亡患者[3]。

在这次冠状病毒的全球紧急事件中，对抗 COVID-19 的主要医疗策略是使用抗生素和抗病毒药物来阻断病毒复制周期并抑制宿主炎症。 这种策略在某些情况下导致了有效的支持和对症治疗，甚至产生了可喜的结果，但这并不是这种感染的最终治疗方法。 例如，托珠单抗（IL-6受体阻滞剂）、阿达木单抗（抗TNF抗体）、依库珠单抗（抗C5抗体）等免疫调节干预措施可以有效缓解患者症状，但不能从根本上治愈疾病。 事实上，COVID-19肺炎有两大特点：一是免疫力低下的人更容易感染COVID-19[4]，二是主要靶器官是肺部[5]。 事实上，据报道，呼吸衰竭是 COVID-19 死亡的主要原因之一[6]，尸检显示许多患者存在肺损伤、显着渗出反应和肺栓塞[7]。

1.2. 间充质干细胞外泌体 间充质干细胞 (MSC) 已被证明具有全面而强大的免疫调节和再生功能 [8]。 MSCs 可以对抗与慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、特发性肺纤维化、哮喘、ARDS 和肺动脉高压发病机制相关的细胞死亡，并促进细胞再生[9,10]。 外泌体是 MSC 分泌的关键旁分泌效应物之一，由于其与亲本细胞相似的生物相容性和维持愈合特性的能力，被认为是替代 MSC 治疗的有吸引力的候选者 [11]。 在生理和病理条件下，外泌体通过将 miRNA 和蛋白质等各种生物分子转运至靶细胞，在细胞间通讯中发挥关键作用[12]。 与源自细胞表面的凋亡小体和微泡不同，外泌体是通过内吞途径产生的，并加载亲本细胞的细胞质内容物。 因此，它们是亲本细胞的迷你版，模仿了它们的某些生理特征。 与细胞对应物相比，外泌体的无毒性、低免疫原性、高稳定性、易于储存和作为现成产品的大规模生产潜力是外泌体的几大优势，这导致它们作为新的治疗替代品在临床应用中得到扩展。 此外，外泌体的天然功能使其能够通过膜融合将其膜和细胞质生物活性成分从亲本细胞递送至靶细胞[13]。 还有其他独特的特征，包括穿越血脑屏障 (BBB) 等生物屏障的天然能力。 此外，生物相容性是另一个特性。 由于其来源于生物来源和固有的靶向能力，外泌体已被用作临床前研究中药物成分的载体[14]。

1.3. 间充质干细胞衍生的外泌体治疗机制 MSC 衍生的外泌体从其亲本细胞继承了免疫抑制特性，MSC-evs 可能使用多种机制来平衡免疫系统的功能。 一个关键机制是重新编程和改变各种免疫细胞的表型。 例如，MSC 衍生的外泌体促进肺泡巨噬细胞存活并将其表型从促炎 (M1) 极化转变为抗炎 (M2) 极化的能力已在至少两项研究中得到证实。 这些发现表明，外泌体可以作为其亲本细胞的可行替代品，而且据报道，这种能力还可以改变 Treg/Teff 比率，从而增加 Treg 并促进抗炎细胞因子的分泌[15,16]。

在多个模型中，MSC-evs 具有与 MSCs 相似的治疗特性，更容易制备、储存和运输到床边，并避免细胞治疗的一些局限性，如肺栓塞和肿瘤形成的风险。 近年来，MSC-evs作为多种疾病的发病机制和治疗药物的生物标志物受到广泛关注。 此外,MSC分泌的外泌体可通过与免疫细胞的相互作用调节免疫,并通过细胞因子抑制炎症反应[17,18]。 大量研究表明，MSC分泌的外泌体可用于治疗免疫缺陷、炎症、ARDS等肺部疾病[19,20]，因此MSC分泌的外泌体也可能有效治疗COVID-19引起的肺部炎症.外泌体是干细胞分泌的主要活性成分之一，大小为30-150 nm。 雾化后外泌体可直接到达细支气管和肺泡,有利于药物的最大吸收[21]。 多项临床试验表明，静脉输注MSCs和MSC-evs治疗SARS-CoV-2引起的严重肺损伤是安全有效的[22]，而在肺损伤的情况下，雾化途径提供了特别靶向肺部部位的有效药物输送方法。 因此，我们推测雾化MSC分泌的外泌体可能是减少COVID-19肺损伤和促进恢复的有效方法。

1.4. 干细胞来源外泌体临床案例研究 近期，由以色列医学中心专家Nadir Arber领导的吸入型抗COVID-19药物Exo-CD24，是外泌体与CD24蛋白的结合，在早期临床试验中取得了可喜的成果. 该药物能够在治疗 5 天内治愈 30 名重症患者中的 29 名，并有可能在 3-5 天内治疗 COVID-19 患者。 尽管 Exo-CD24 尚未通过 III 期试验，但在未来已展现出巨大的潜力[23]。 美国 FDA 已通过 Direct Biologics 进行的 I/II 期试验批准使用细胞外囊泡 (EVS) 治疗 COVID-19。 所使用的 EVS ExoFlo 通过减少持续炎症、促进受损组织的血运重建和重塑疤痕组织来恢复患者的健康和活力。 国内的临床研究也已启动，江苏省无锡市第五人民医院的临床研究证实，雾化脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡是治疗COVID-19安全可行的方法。 该研究于今年 6 月发表在 Stem Cell Reviews and Reports 上，纳入了 7 名确诊为 COVID-19 肺炎的患者，其中包括两名重症患者（患者 2 和 4）和五名轻症患者（患者 1、3、5、6、和 7). 雾化治疗后2小时内，所有患者均未出现咽喉肿胀、皮疹、气短、头晕、呕吐、低血压等急性过敏反应。 治疗后也没有报告不良事件或继发性过敏反应。 胸部 CT 扫描显示，在使用 MSC 衍生的细胞外囊泡进行雾化治疗后，重度和轻度患者的肺叶结节密度和肺部病灶吸收均有所降低 [21]。 瑞金医院和金银潭医院正在联合研究使用脂肪来源的人同种异体间充质干细胞来源的外泌体（HAMSCs-Exos）雾化治疗 COVID-19。 七名重症 COVID-19 患者通过雾化吸入接受 HAMSC-Exos 治疗，所有患者对治疗的耐受性良好，在雾化期间或雾化后立即没有不良事件或临床不稳定的证据。 所有患者在吸入 HAMSC-Exos 气雾剂后均表现出血清淋巴细胞计数增加（中位数为 1.61×10^9/L vs 1.78×10^9/L），所有患者肺部病变均有不同程度减少，其中 4 例患者显示出显着的改善。 初步结果表明，参与者的肺损伤情况得到明显改善[21]。

然而，大多数使用干细胞外泌体治疗 COVID-19 感染的临床试验存在以下问题： (a) 样本量小，难以有效证明干细胞外泌体在 COVID-19 治疗中的优势； (b) 缺乏对照组； (c) 使用传统的二维生产方法，难以大规模生产用于临床治疗的大量外泌体； (d) 缺乏对相关现象的深入机制探索。 这些问题阻碍了使用干细胞外泌体治疗 COVID-19 感染的进展。 针对这些问题，本项目提出将雾化脐带间充质干细胞外泌体与常规治疗相结合，治疗中重度COVID-19患者，并评估其安全性和有效性。