NKG2D-CAR-NK细胞治疗难治性复发性多发性骨髓瘤的临床研究

多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞克隆异常增殖的恶性疾病。 它是血液系统肿瘤中第二常见的恶性肿瘤。 发病率为2-3/100000，且尚无法治愈。 近年来，随着蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、抗CD38单克隆抗体等新药方案的应用，MM患者的缓解率明显提高，化疗相关毒副作用减少，延长了患者的生存期。多发性骨髓瘤2-3年至5年以上。 强化诱导治疗后序贯自体造血干细胞移植是目前适合造血干细胞移植患者的首选治疗策略。 对于复发难治性多发性骨髓瘤，新一代口服蛋白酶体抑制剂、单克隆抗体、特异性细胞免疫疗法已显示出良好的治疗效果。 然而，多发性骨髓瘤仍然是一种不治之症，需要探索更有效的治疗方法，以提高复发难治性多发性骨髓瘤的疗效并延长生存时间。

近年来，CAR-T在血液恶性肿瘤中取得了显着的治疗效果。 嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫治疗是近年来快速发展的肿瘤过继免疫治疗新方法。 其主要特点是通过基因工程修饰获得识别肿瘤抗原特异性受体的T细胞，并赋予其靶向性、杀伤性和持久性。 具有MM抗原特异性的CAR-T研究也已开展并取得了良好的结果。 CAR-T细胞疗法已成为治疗MM的有效新疗法，其中B细胞成熟抗原（BCMA）成为CAR-T细胞疗法的明确靶点。 BCMA CAR-T细胞可以识别并杀死来自MM患者的MM细胞，并通过穿孔素途径在MM模型小鼠中发挥抗肿瘤作用。 抗小鼠BCMA CAR-T细胞治疗复发/难治性MM的总体有效率可达81%，患者CR率为55.5%，严格完全缓解（sCR）为13.3%。 然而，随着CART细胞疗法应用时间的增加，复发仍然是不可避免的问题，大约40%接受CR的患者仍然出现复发。 同时，研究表明多靶点CAR-T可以延长缓解期，减少复发。 扩大MM细胞靶点的覆盖范围，清除低分化的MM细胞，可能会进一步提高CAR-T治疗复发难治性MM的疗效。 小鼠实验模型研究证实，抗CS1 CAR-T与抗BCMA CAR-T联合治疗比单独使用抗BCMA CAR-T对骨髓瘤细胞具有更好的治疗效果。 临床试验证实，使用小鼠源性抗BCMA CAR-T细胞联合人源化抗CD19 CAR-T细胞输注治疗复发难治性MM，ORR为95.2%，MRD阴性转化率为81.0%。 但随着随访时间的延长，患者逐渐出现复发。 因此，尽管CAR-T疗法在治疗多发性骨髓瘤方面取得了积极的临床效果，但复发仍然是一个难以克服的问题，需要更多的治疗方法来解决这一问题。

虽然CAR-T细胞具有很强的肿瘤杀伤能力和特异性的靶向结合能力，但CAR-T治疗中的问题也不容忽视。 首先，CAR-T疗法具有相关的毒副作用，主要包括：（1）自身免疫毒性主要指“在靶/脱瘤”毒性反应。 CAR细胞攻击肿瘤细胞的同时也攻击表达相同抗原的正常组织，对正常组织造成损伤。 （2）细胞因子释放综合征（CRS），这是一种超出生理状态的高水平免疫激活引起的非抗原特异性毒性，也是CAR-T细胞免疫治疗最突出的毒性反应。 CRS常伴有多种炎症细胞因子的增加，如IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-γ等。 CRS的临床表现差异很大，以发热最常见，肌肉疼痛、恶心、不稳定低血压、缺氧也常见。 总体症状范围从轻微的流感样症状到严重的危及生命的症状，如呼吸窘迫、多器官功能障碍，甚至衰竭。 (3)部分受试者还出现神经毒性，这是一种意想不到的毒副作用，主要包括意识模糊、昏迷、失语、运动障碍、癫痫发作等症状。 其次，CAR-T细胞的制备周期长，不适合病情进展较快的患者。 目前，研究人群CAR-T细胞的制备多基于自体外周血采集和慢病毒转染。 T细胞在重新输入患者体内之前需要经过分选、激活、转染、扩增等一系列操作，一般需要2-3周的时间。 一方面无法满足病情快速进展的患者的迫切治疗需求，另一方面长期体外培养导致CAR-T细胞在体内过度分化，导致生存、增殖降低，和体内杀伤能力，降低治疗效果。 最后，CAR-T的疗效可能会受到早期化疗的影响。 目前临床应用的CAR-T多采用自体T细胞制备，复发/难治性AML患者接受多次化疗治疗，导致T细胞功能受损，影响CAR-T疗效及患者预后。 因此，有必要寻求新的替代治疗方法。

NK细胞是体内重要的免疫细胞，是先天免疫的重要组成部分。 生理条件下，NK细胞抑制性受体识别正常组织细胞表面广泛表达的MHC I类分子，从而抑制NK细胞功能，阻止其杀伤自身正常组织细胞。 在肿瘤组织中，由于肿瘤细胞表面MHC I类分子表达下调，激活NKp30、NKp44、NKp46等受体的配体上调，导致NK细胞活化，最终杀死肿瘤细胞。 CAR-NK细胞在NK细胞表面表达CAR分子，通过CAR识别靶抗原，进一步激活NK细胞杀伤肿瘤细胞。 CAR-NK细胞的CAR结构通常由三部分组成，即胞外抗原结合域、跨膜域和胞内激活域，这与CAR-T细胞治疗中使用的CAR结构非常相似。 根据胞内结构域的不同，CAR结构也将进行相应的比较和验证。

与CAR-T细胞疗法相比，CAR-NK细胞在过继性细胞疗法中有其独特的优势：1）CAR-NK细胞经历细胞因子风暴的概率较低。 CAR-T细胞分泌的促炎细胞因子，如IL-1和IL-6，是引起CRS的主要细胞因子。 活性CAR-NK细胞通常产生TNF-α。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和T淋巴细胞产生的细胞因子类型存在显着差异。 临床研究表明，CAR-NK治疗显着降低了细胞因子风暴的概率。 2）CAR-NK细胞具有多重杀伤机制，可以杀伤靶抗原低表达或不表达的肿瘤细胞，减少靶抗原阴性肿瘤的复发。 CAR-T细胞难以识别靶抗原低表达或不表达的靶细胞，这些细胞无法被清除，导致肿瘤复发。 CAR-NK细胞不仅通过单链抗体识别肿瘤表面抗原来杀伤肿瘤细胞，还可以激活各种受体识别配体来杀伤肿瘤细胞。 如天然细胞毒性受体（NKp46、NKp44 和 NKp30）、NKG2D 和 DNAM-1。 此外，NK细胞通过FcγRIII（CD16）诱导抗体依赖性细胞毒性，多种机制联合杀伤异质肿瘤细胞，从而降低肿瘤复发的风险。 3）CAR-NK细胞同种异体移植不会引起移植物抗宿主病（GvHD）。 当测试群体中的 CAR-T 细胞是由与人类白细胞抗原 (HLA) 不匹配的健康捐赠者生成时，同种异体 CAR-T 细胞上表达的非自体 MHC 会诱导免疫排斥并导致严重的血液毒性。 NK 细胞是不依赖 MHC 分子识别的先天免疫细胞。 同种异体 CAR-NK 细胞不会诱导 GvHD 产生。 4）NK细胞来源多样，满足细胞质量和数量受到多次化疗影响的患者的需求。 NK细胞可以从人脐带血、外周血、诱导多能干细胞和NK-92细胞系中获得。 对于因多次化疗而难以收集到足够细胞的患者，多种来源的NK细胞可以满足CAR-NK治疗的需要。 5）CAR-NK细胞可以提供及时的“点式”治疗。 NK细胞不受主要组织相容性复合物的限制，因此，同种异体NK细胞可用于修饰和开发成现成的CAR-NK细胞疗法。 对于肿瘤进展较快的患者，可以及时给予治疗，避免因等待细胞制备而导致病情进展。

NKG2D 受体是表达 NK 细胞表达的激活受体。 它可以识别肿瘤细胞中表达的NKG2D配体（NKG2DL），并通过NKG2D-NKG2DL相互作用激活NK细胞杀伤活性。 NKG2DL位于6号染色体的不同位置，属于两个基因家族，包括MICA/MICB和ULBPs。 NKG2D配体在肿瘤细胞或病毒感染细胞表面有不同水平的表达，而在正常细胞表面不表达，超过70%的人类肿瘤细胞表现出NKG2D配体上调。 我们前期的研究表明，U266骨髓瘤细胞系和超过62%的MM患者表达不同水平的NKG2D配体，免疫细胞可以通过NKG2D受体与配体之间的相互作用介导对MM细胞的杀伤。 靶向NKG2DL CAR-NK细胞治疗MM在临床前实验中取得了良好的治疗效果。 与此同时，5 名复发性 MM 接受了 NKG2D-CAR-NK 细胞治疗，没有出现治疗相关的不良反应、剂量限制性毒性，也没有观察到 CRS 反应。 临床前研究表明，NKG2D-CAR-NK对MM细胞比单纯扩增和活化的NK细胞具有更强的细胞毒作用，为NKG2D-CRA-NK治疗MM提供了基础。

因此，选择NKG2DL作为治疗AML的靶点主要有三大优势：一方面，其在肿瘤细胞上的特异性表达可以保证CAR-NK药物的安全性，避免严重的脱靶毒性；此外，NKG2D配体的多样性可以在一定程度上避免MM细胞异质性或单一靶点缺陷导致的肿瘤复发，更好地维持药效；最终，NKG2DL作为MM的治疗靶点获得了积极的临床数据。 因此，研究人员计划评估联合输注NKG2D-CAR-NK细胞治疗复发性多发性骨髓瘤的有效性和安全性。 本研究的临床数据可为复发难治性MM新的治疗方案提供数据支持。