皮内与肌肉注射狂犬病疫苗的安全性和免疫原性

狂犬病流行病学：

狂犬病是一种可通过疫苗预防的人畜共患病毒性疾病，主要攻击中枢神经系统，导致严重的神经系统症状，若不治疗，致死率为100%。 它通过受感染动物的咬伤或唾液传播，在全球范围内，狗是人类感染最常见的来源。 病毒从感染部位通过周围神经传播至大脑，引起脑炎，表现为意识模糊、躁动、麻痹，最终昏迷和死亡。

在全球范围内，狂犬病每年导致约59,000人死亡，其中大多数发生在亚洲和非洲。 令人担忧的是，受影响者中有40%是15岁以下的儿童。 这种感染每年带来86亿美元的经济负担。 孟加拉国也存在类似情况。 孟加拉国在全球狂犬病感染数量中排名第三，仅次于中国和印度。 2009年，孟加拉国与狂犬病相关的人类死亡人数估计超过2,000人。 然而，由于自2010年开始实施“国家狂犬病消除计划”，其中包括引入细胞培养疫苗，死亡人数稳步下降至2020年的26人。

从孟加拉国视角看狂犬病治疗：

尽管出现症状后最终是致命的，但狂犬病通过疫苗接种可以100%预防。 路易·巴斯德于1885年首次对患者施用狂犬病疫苗。 目前，有两种类型的疫苗可用于预防狂犬病：神经组织疫苗和细胞培养疫苗。 世界卫生组织（WHO）建议尽快用更有效、更安全的细胞培养疫苗替代神经组织疫苗。 细胞培养疫苗的最新进展使其更经济实惠且所需剂量更小。 基于细胞培养的狂犬病疫苗可通过两种不同途径接种：肌肉注射（IM）和皮内注射（ID）。 根据孟加拉国《动物咬伤管理国家指南》，狂犬病预防可采用（i）暴露前预防（PrEP）的1部位IM方案或2部位ID方案，以及（ii）暴露后预防（PEP）的1部位IM方案或2部位ID方案。 如多项研究所观察到的，IM方案在临床环境中更常用。 然而，先前研究发现IM方案会引起严重不良事件（SAE）。 在接受肌肉注射狂犬病疫苗方案七天后，报告了贝尔氏麻痹症作为疑似意外SAE。 此外，全球多项研究已证明ID方案在血清保护方面优于IM方案。

在孟加拉国引入皮内狂犬病疫苗方案可能具有重大的公共卫生意义。 作为一个狂犬病负担重且资源有限的国家，孟加拉国可以从更具成本效益的疫苗接种方法中极大受益。 鉴于皮内途径使用的疫苗量显著减少（每剂量最多减少80%），与肌肉注射相比成本降低约75%，采用该方案可在预算限制内实现更广泛的疫苗覆盖，并大幅减轻狂犬病的经济负担。 这可能有助于提高狂犬病预防的可及性，特别是在农村和服务不足地区，那里成本是疫苗接种的主要障碍。 此外，皮内途径的剂量节约特性有助于缓解偶尔在全球报告的疫苗短缺问题。 通过进行此项试验，我们旨在提供本地证据以支持采用这种WHO推荐的方法，可能彻底改变孟加拉国的狂犬病预防策略。

本研究旨在确定Popular Pharmaceuticals PLC生产的Inj. Rabivax ID/SC（试验药）和同一制造商生产的Inj. Rabivax IM（2.5 IU/ml）（参照药）在健康参与者中以暴露前预防剂量皮内接种的安全性和免疫原性。

什么是血清转化？ 个体在接种疫苗或暴露于任何抗原后产生抗体称为血清转化。 根据WHO，充分的抗体反应通常定义为在完成最终疫苗接种剂量后14天和28-30天达到0.5 IU/ml或更高。 免疫实践咨询委员会（ACIP）已认可此狂犬病病毒中和抗体（RVNA）水平，从而取代先前设定的0.1-0.3 IU/ml的最低可接受狂犬病抗体滴度（16）。 此更高限值为确定反应不足和加强剂需求提供了更保守的方法。 RVNA水平通常通过两种血清学检测之一进行评估：快速荧光灶抑制试验（RFFIT）或荧光抗体病毒中和试验（FAVN）。 在本研究中，我们将重点使用RFFIT评估RVNA水平。 RFFIT是一种血清学检测，可量化狂犬病特异性抗体的中和能力，反映其抑制病毒感染易感细胞的能力。 此研究程序使用患者血清的系列五倍稀释液，随后与标准化攻击剂量的活狂犬病病毒混合。 孵育后，将血清/病毒混合物引入易感细胞培养物。 通过荧光抗体染色评估病毒细胞病变效应的抑制来确定RVNA的存在。 终点滴度基于显示显著中和作用的最高血清稀释度计算。 由于世界卫生组织（WHO）和免疫实践咨询委员会（ACIP）认为RFFIT试验中1:5血清稀释度下完全中和的RVNA水平是狂犬病疫苗接种充分免疫反应的证明，此试验将为我们提供试验疫苗的准确免疫原性。

评估入组参与者的血清转化率将是本研究的主要结局指标之一。 血清转化率定义为完成疫苗接种4周后RVNA水平≥0.5 IU/mL的受试者比例。 我们将进行比较分析，以确定接受皮内和肌肉注射狂犬病疫苗接种的参与者之间血清转化率的非劣效性。

安全性概况 狂犬病疫苗生产涉及三种主要类型：现已基本过时的神经组织疫苗、现代细胞培养疫苗和源自鸡胚的疫苗。 WHO指南推荐细胞培养和鸡胚狂犬病疫苗而非神经组织疫苗，因为后者存在严重不良事件和免疫原性降低的风险，包括由于病毒灭活不完全而可能导致狂犬病传播。 相比之下，细胞培养和鸡胚疫苗表现出良好的安全性，通常耐受性良好。 在我们的研究中，试验组和参照组都将使用纯化Vero细胞疫苗（PVRV）。 通过使用无血清培养基和无动物来源的胰蛋白酶样酶，这种细胞培养疫苗旨在最大程度降低超敏反应以及细菌、真菌和支原体等污染物传播的风险。 此外，Frazatti-Gallina等人证明了PVRV在小鼠模型中的安全性。 我们研究疫苗制造商进行的一项中国试验确定了该疫苗在小鼠模型中的安全性。 此外，该疫苗在不同年龄组的健康参与者中已被证明是安全的。 先前研究也证明了这些狂犬病疫苗在孕妇中的安全性。 这些纯化Vero细胞疫苗会产生轻度至中度不良事件，如红斑、疼痛、接种部位肿胀和发热，这些通常无需治疗即可自行缓解。 与PVRV疫苗相关的严重不良事件罕见，估计发生率为每10万人中1例。

由于其已证实的良好安全记录，该疫苗可合理施用于健康个体。 既定的安全性概况证明我们在健康个体中进行非劣效性试验是合理的。 然而，我们熟练的工作人员将正确接种疫苗，同时保持安全和无菌操作，以最大程度减少任何并发症。 我们将在最终疫苗接种后六个月进行随访评估，以确定是否发生任何长期不良事件，并在需要时提供适当治疗。

疫苗效力 疫苗抗原引发的可量化生物活性称为其效力。 根据WHO，狂犬病疫苗的效力应为2.5 IU/肌肉注射剂量，以确保接种后引发充分的免疫反应。 1 ml Inj. Rabivax IM含有2.5 IU狂犬病抗原，符合WHO推荐的效力标准。 另一方面，皮内狂犬病疫苗方案仅需0.2 ml剂量（每臂0.1 ml），对应效力≥0.5 IU/剂量。 多项研究显示皮内剂量效力范围为0.22-2.32 IU。 由于皮内方案需要多部位接种和分次给药（因为真皮层富含抗原呈递细胞），疫苗中的此抗原水平足以产生与IM方案相似的免疫原性。

适当剂量 根据WHO指南，肌肉注射狂犬病疫苗方案的剂量为1 ml，而皮内方案的剂量为0.2 ml（每臂0.1 ml）。 我们将遵循指南，因为出于实际原因，每个皮内部位接种0.1 ml被认为是适当的，并能产生相似的血清保护水平。 我们还将按照推荐的给药时间表，给参照组接种1 ml Inj. Rabivax IM。 由于WHO已经建立并标准化了皮内和肌肉注射的剂量，我们将不包括剂量反应评估。

适当疫苗接种时间表 皮内和肌肉注射狂犬病疫苗方案的给药时间表已纳入国家指南。 我们将遵循两种疫苗的2剂方案。 在试验组中，将在第0天和第7天于双侧三角肌区域皮内接种0.1 ml Inj. Rabivax。我们将根据国家指南的说明，在参照组第0天和第7天于单臂三角肌区域肌肉注射1 ml Inj. Rabivax（2.5 IU/ml）疫苗。

非劣效性试验的合理性 根据DGDA的监管要求，先前已获许可和批准的药品需要通过替代途径给药上市需要额外批准。 因此，一项比较Popular Pharmaceuticals PLC生产的皮内接种狂犬病疫苗与肌肉注射狂犬病疫苗在免疫原性和安全性方面非劣效性的临床试验，可为其在孟加拉国人群中的使用提供基础和证据。

年龄组的合理性 纯化Vero细胞狂犬病疫苗已被证明在所有年龄段儿童中非常安全且耐受性良好。 根据《动物咬伤管理国家指南》，该疫苗已在孟加拉国所有年龄段人群中使用。 因此，我们将评估皮内疫苗在所有年龄段中安全性和免疫原性的非劣效性，以加强试验生成的证据，这是DGDA授予疫苗上市许可所必需的。

随访时间表的合理性 我们将在第21天、第35天和第187天对参与者进行随访。 由于疫苗接种后的RVNA水平在2-4周达到峰值，前两次随访将使我们能够分析参与者的准确血清转化率。 我们将在第365天进行最终随访以进行安全性评估，评估任何可能长期显现的不良反应。

疫苗对国家计划的适用性 我们将在迈门辛医学院医院（迈门辛）传染病与热带医学科（Surya Kanta医院）进行此项研究。 由于孟加拉国《动物咬伤管理国家指南》推荐使用皮内狂犬病疫苗进行狂犬病管理，研究疫苗很可能适合国家计划使用。

暴露前预防评估的合理性 这将是一项评估皮内狂犬病疫苗方案安全性和免疫原性的非劣效性试验，而该方案已有已获许可的肌肉注射方案。 因此，我们专门评估两种给药途径下狂犬病疫苗的暴露前预防剂量。

参与者接受暴露前疫苗接种后的益处 一旦参与者完成PrEP方案，普通人群将无需常规加强剂量。 如果个体的RFFIT抗体滴度保持≥0.5 IU/mL（ACIP设定的最低标准），他们将被视为对未来任何狂犬病暴露已预先免疫。 对于未来的任何暴露，暴露后预防仅需两剂狂犬病疫苗，在第0天和第7天接种。

排除回忆反应评估的理由：

再次暴露于抗原会引发快速、强烈的免疫反应，称为回忆反应。 作为本研究的一部分，我们专门关注皮内疫苗方案的安全性和免疫原性概况。 由于回忆反应超出了我们研究目标的范围，我们将不对此进行调查。

研究人群和样本量：

我们将通过社区外展和本地广告招募参与者。 有兴趣的个人将被邀请至研究地点进行初步筛选评估。 筛选前，潜在参与者将为筛选程序提供知情同意。 我们将基于既定的选择标准进行彻底评估。 我们将邀请符合所有资格标准的个人参与研究。 入组前，我们将全面解释研究的目的、程序、潜在风险和益处。 我们将为参与者提供充分提问的机会。 在获得书面知情同意后，我们将招募健康个体参与研究。 每位参与者将被分配一个唯一的受试者编号，用于在研究期间识别实验室样本和所有相关文件。 如果参与者在筛选过程中未能符合资格，其受试者编号将不会分配给另一个人。 在筛选期间不符合纳入或排除标准的参与者将被视为筛选失败。 筛选失败的数据将记录在源文件中。

研究设计：

如果比例差异（皮内减肌肉注射）的双侧95%置信区间下限大于-5%，则可得出皮内方案与肌肉注射方案相比的非劣效性结论。 选择5%的非劣效性界值是基于临床考虑和监管指导，因为它代表了两种给药途径之间血清转化率在临床上可接受的差异。

参与者的筛选和入组（-7天）：

为招募健康参与者，我们将采用本地广告和社区外展相结合的方法，包括报纸广告、有线电视广播、传单分发以及通过校园信息传播针对大学生的外展。 这种广告和外展方法的结合旨在最大化我们的覆盖范围，吸引多样化的合格参与者。 抵达研究地点后，我们将向有兴趣的个人全面介绍研究的性质、目的、益处和潜在风险。 获得筛选程序的知情同意后，我们将使用多项纳入和排除标准对参与者进行彻底评估。 成功完成资格评估并经研究团队确认后，参与者将被邀请入组研究。 我们将彻底解释我们研究的性质和目的。 此外，我们将告知他们接种研究疫苗的潜在益处和危害。 根据孟加拉国监管机构的规定，如果发生与研究相关的伤害/死亡，将向参与者提供免费医疗管理和经济补偿。 将鼓励他们就研究提出问题，并提供充足时间做出知情决定。 获得书面知情同意后，研究者将保留原始签署的同意书与研究文件。 将向受试者提供一份签署的知情同意书（ICF）副本。

此项单周期研究将在随机化过程前有7天的筛选期。 筛选详情将记录在筛选日志中并记录在站点主文件中。 参与者将根据以下选择标准由研究医生进行细致的筛选。

参与者退出：

在研究期间的任何时间，如果发生以下任何情况，参与者将被退出/终止：

1. 参与者不再愿意参与研究
2. 入组参与者时发生方案违反
3. 参与者对研究疫苗有不良反应，威胁其健康
4. 发生任何严重不良事件（SAE）或研究者判断的任何外渗症状或体征
5. 受试者在研究期间需要接种狂犬病或任何其他疾病的任何伴随疫苗
6. 申办方终止研究
7. 研究者判断（出于安全原因）。

不良事件（AE）/严重不良事件（SAE）：

当参与者在研究期间退出参与时，研究者应在医疗记录中明确记录原因，并在病例报告表（CRF）的指定页面上完成描述终止条款的内容。 必须确保在所有访视中进行适当评估。

筛选期间（第-7天），参与者将接受知情同意、资格评估、人口统计学和病史回顾、体格和系统检查、生命体征测量、心电图、妊娠和传染病检测、实验室检查以及用药回顾。 筛选访视时将记录筛选前1个月内服用的所有药物。 筛选和入组后，将为每位受试者分配唯一识别号，其详细信息（年龄、性别、体重等）将记录在相应文件中。

筛选、入组和治疗组分配后，受试者将以门诊方式入院，并在疫苗接种期间留在研究病房。 接种疫苗前将进行一般和系统检查，并评估生命体征。 将在第0天接种疫苗前5分钟内抽取静脉血样本（10 mL）以确认稳态条件。 由于筛选和第0天之间仅有短暂的七天间隔，为了效率和最小化参与者负担，我们将依赖筛选血液检测结果（全血细胞计数、随机血糖、肌酐、谷丙转氨酶、天冬氨酸氨基转移酶和电解质）。 此全面的基线评估将确保试验的安全性和有效性。

疫苗将根据国家动物咬伤管理指南的暴露前预防（PrEP）方案在第0天和第7天接种。 疫苗接种期间将保持适当的无菌措施，并由专业人员接种分配的疫苗。 随后将观察参与者30分钟，任何AE或SAE都将系统地记录在受试者文件中。

随访访视（第21天和第35天）：

将在第21天和第35天再次采集血样以评估血清中的狂犬病病毒中和抗体（RVNA）。 根据免疫实践咨询委员会指南，RVNA水平≥0.5 IU/mL表明对疫苗接种有充分反应（39）。 我们将在第21天评估各种血液参数（全血细胞计数、谷丙转氨酶、血清肌酐、血清电解质、天冬氨酸氨基转移酶），并在第21天和第35天评估RVNA水平，以确定新疫苗方案的安全性和免疫原性。 此外，我们将确保参与者在研究期间不服用任何伴随药物。 研究医生将在第21天和第35天进行一般和系统检查，届时将评估AE、SAE和生命体征。

研究结束访视（第187天）：

在此次访视中，将从每位参与者处获取总共15 mL血样用于安全性调查和RVNA水平评估。 我们将记录生命体征并进行一般和系统检查。

将检查伴随用药并记录不良事件。 将进行心电图记录以排除任何异常。 经过此全面评估后，参与者将从医院出院。

用于筛选和研究结束时安全性评估的血液量为15 mL。 研究期间总失血量为55 mL。 根据研究者的判断，可能会采集额外的血样以确保参与者在研究期间的安全。

退出访视：

如果参与者满足第二部分规定的任何退出标准，我们将提前将其从研究中退出。 退出时将执行的程序包括一般和系统检查、生命体征评估、临床安全性实验室检查和心电图。 此外，将进行AE评估。 还将记录伴随用药的详细信息。

研究产品责任：

研究疫苗由Popular Pharmaceuticals PLC作为单一批次提供给研究者。 此药物必须安全存储在研究者站点的上锁、限制进入区域，并且仅在研究者或其授权人员的监督下分发给符合条件的参与者。 疫苗必须按照标签规定的条件储存。 研究者将记录疫苗的接收情况。 研究疫苗向试验参与者的分发和退回将记录在由Popular Pharmaceuticals PLC提供的IP日志中。 研究完成后，研究者将在站点保留所有已使用、未使用、有缺陷和保留的疫苗，或将其运送给第三方，并记录此操作。 研究者或工作人员必须使用药物责任表准确记录所有研究疫苗的接收和分发情况，这些记录必须可供检查。

研究产品的包装和标签 Popular Pharmaceuticals PLC（孟加拉国）将供应研究疫苗并提供给研究者。 疫苗将根据适用法规进行包装和标签，包括“仅供临床试验使用”以及至少包含活性成分名称、参与者编号、研究编号、剂型、使用说明、储存说明、数量、有效期、批号以及申办方和制造商的名称和地址。 研究产品也将根据适用的研究法规进行标签。 研究疫苗必须在站点安全储存，遵循方案规定的条件。 疫苗使用将在整个研究过程中详细记录。 未使用的疫苗和留存样品将储存在站点或转移给制造商。

参与者分配至治疗序列的方法：

此项开放标签研究将使用1:1随机化（试验/参照）方案确定每位参与者的治疗方案。 参与者满足所有资格标准、提供知情同意并随机化后，将接受其分配的治疗。 参与者编号在整个研究期间将保持一致，参与者只能参与一次。 退出的参与者不能重新入组。 如果参与者在随机化后撤回同意或因某种原因未接受治疗，其分配的随机化编号将不会被重复使用。

实验室功能：

RVNA评估：

我们考虑了多个时间点以评估短期和长期抗体持久性。 与监管机构讨论并考虑项目可行性后，我们决定将疫苗接种后14天和28天作为短期随访时间，疫苗接种后180天作为长期随访时间，以使用每组中抗体滴度高于保护限值（≥0.5 IU/ml）的受试者百分比评估主要终点。 血样将通过留置在肘前静脉的套管采集。 给药后样本将在疫苗接种后3天的预定时间内采集，记录采集结束时间精确到分钟。 允许有+/-30分钟的窗口期用于给药后样本采集。 将尽一切努力按时采集样本，实际采集时间将用于数据分析。 如果血样采集与其他研究事件（生命体征）时间重合，将遵循以下顺序：先采集血样，后测量生命体征。 RVNA将使用WHO和OIE手册中发布的RFFIT方法在血清样本中测量。 简而言之，每个血清样本（重复）100 μL将在补充了10%胎牛血清的EMEM中系列稀释，并加载到8孔Lab-Tek腔室玻片中。 然后，加入100 μL攻击病毒（50TCID50）。 玻片将在37°C孵育90分钟，随后每孔加入200 μL含5×10^5 BHK-21 C13细胞的悬浮液（在补充了10%胎牛血清的EMEM中）。 然后将其置于2-5% CO2培养箱中，37°C孵育24小时。 孵育后，玻片将洗涤，在80%冷丙酮中固定，干燥，并用FITC标记的抗狂犬病抗体染色。 将在荧光显微镜下使用100倍放大倍数检查每孔20个视野是否存在狂犬病病毒。 RVNA滴度将使用Reed-Muench方法计算。 每次测试将包括国际标准狂犬病免疫球蛋白（WHO SRIG）、内部RVNA标准和幼稚血清作为对照。 SRIG也将作为计算样本IU/mL值的校准品。

ELISA：

我们将进一步进行ELISA（酶联免疫吸附试验）以检测血清或血浆中的狂犬病抗体，利用包被在微孔板上的狂犬病抗原。 如果存在抗体，它们将与抗原结合，随后使用酶标记的二抗进行检测。 然后加入底物，产生颜色变化，其与狂犬病抗体的存在和浓度相关，将使用酶标仪测量。 该过程将涉及几个关键步骤：抗原包被、封闭未结合位点、与测试和对照样本孵育、加入酶标记的二抗、底物反应和吸光度测量。 适当的验证、阳性和阴性对照的包含、优化稀释以及彻底洗涤对于准确结果至关重要。 处理狂犬病抗原和样本时将严格遵守生物安全预防措施。 该程序将根据我们合作组织的标准操作程序（SOP）进行。

不良事件（AE）定义和报告：

不良事件定义为与人类药物使用相关的任何不良医学事件，无论是否被认为与药物相关。 因此，它可以是与使用研究性治疗暂时相关的任何不利和非预期的体征（包括异常实验室发现）、症状或疾病，无论是否被认为与研究性治疗相关。 AE的定义包括在首次研究性药品（IMP）给药前已存在的状况/异常（“病史”）的恶化（严重程度和频率），以及评估为“具有临床意义”的程序（如心电图、X光）或实验室结果异常。

严重不良事件（SAE）：

如果不良事件或疑似不良反应在研究者或申办方看来导致以下任何结果，则被视为“严重”：死亡、危及生命的不良事件、住院或延长现有住院时间、持续或显著的残疾或正常生活功能严重受损，或先天性异常/出生缺陷。

不良事件报告期：

在指定报告期内发生的所有不良事件（AE）必须报告给数据安全监测委员会（DSMB）。 对于非严重AE，报告从首次试验药物给药开始，持续到结账访视。 此外，任何与研究程序相关的非严重AE必须在筛选期间（从签署知情同意书开始）报告。 所有严重不良事件（SAE）必须从签署知情同意书时起报告，直到受试者试验参与结束。

不良事件随访：

所有不良事件（AE）应监测直至其消退、被研究者视为慢性或稳定，或受试者试验参与结束（即直到其最终报告完成）。 此外，所有严重AE和被认为可能与研究药物相关的非严重AE，即使在受试者试验参与结束后也必须进行随访。 这些事件应监测直至其消退或被评估为慢性或稳定。 这些事件的消退必须在CRF和SAE表格上记录。

数据分析：

将使用Microsoft Access准备数据录入程序。 数据录入将计算机化并进行双录入，随后进行数据质量控制措施，包括范围和一致性检查。 将通过比较录入数据与原始病例报告表来解决差异。 最后，所有数据将合并到单个数据库中，使用STATA版本17进行统计分析。

数据安全监测计划：

参与者保密性将严格保护并报告给DSMB。 如果中期分析数据导致初始假设/具体目标需要重大重新考虑，我们将寻求DSMB的指导，以确定完成研究的进一步方法。 最终会议将在研究结束时举行。 此外，任何SAE将立即报告给DSMB，并且研究将暂停，直到收到DSMB的进一步指示。 所有AE将记录在参与者信息表中。 数据监测将非盲。

合作安排：

我们将与德国WHO参考实验室Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie合作。 我们将样本运送给我们的合作者，他们将协助我们进行RFFIT和ELISA。