缺血修饰白蛋白在 COVID-19 患者中的作用

内皮激活和功能障碍与 COVID-19 严重程度相关。 流行病学研究表明，COVID-19 导致的重症病例或死亡通常伴有潜在的合并症，例如高龄、高血压、糖尿病和心血管疾病。 内皮功能障碍、随后使用补体、高凝状态和凝血酶的产生似乎是 COVID-19 各种临床体征和症状的共同点，它们与血栓栓塞事件直接相关。 COVID-19 患者的尸检结果显示，与 H1N1 流感患者和未感染的对照组相比，COVID-19 患者出现了灾难性的微血管损伤，肺内皮炎、血栓形成和血管生成是肺部明显的病理生理特征。

静脉血栓栓塞性疾病可表现为深静脉血栓形成 (DVT) 或肺栓塞 (PE)，尽管进行了预防性抗凝治疗，但仍常发生在重症 COVID-19 患者身上。 尽管接受了抗凝治疗，但仍有近 20% 的患者存在 PE。 在另一项研究中，对 12 名 COVID-19 患者进行了尸检，其中正在接受抗凝剂治疗。 在 7 名 (58%) 患者中检测到 DVT，尽管他们都没有临床怀疑。 PE 是 4 名患者死亡的主要原因。 入住重症监护病房 (ICU) 的重症 COVID-19 患者静脉血栓形成的发生率特别高 (14-81%)。 事实上，PE 已被记录为这些患者中最常见的血栓并发症，发生率高达 81%。 在住院的 COVID-19 患者中，静脉血栓形成的发生频率较低 (3-21%)，而门诊患者的数据不足。 除 DVT 外，可能需要手术的上肢或下肢急性缺血病例也被报告为 COVID-19 中不太常见的动脉血栓并发症。

此外，急性心肌缺血是 COVID-19 最常见的心血管并发症。 心肌缺血的患病率从 7% 到 28% 不等。 研究表明，住院患者肌钙蛋白的增加与更严重的临床病程和更差的预后相关。

缺血性中风是 COVID-19 的另一种常见的肺外血栓栓塞并发症。 有报道称缺血性中风是感染的首发症状（尤其是大脑中动脉血栓形成，即使在年轻患者中也是如此），也是住院期间的并发症。 在回顾性观察研究中，该人群中缺血性卒中的患病率在 1.3% 至 46% 之间。 COVID-19 期间最可能的中风机制被认为是随后的高凝状态和通过激活炎性细胞因子导致的血管内皮功能障碍。

人血清白蛋白是一种肽，由 585 个氨基酸按人体特定序列键合而​​成。 缺血修饰白蛋白 (IMA) 分子是在 2000 年代初期发现的，当时观察到缺氧诱导的局部缺血导致循环白蛋白分子发生修饰。 在局部缺血条件下，白蛋白的 N 末端会发生分化，这可能是缺氧、氧化、自由基和膜中能量依赖性变化的结果。 可以间接评估白蛋白 N 末端的这种修饰。 当钴（体外）添加到缺血样本中时，正常的白蛋白分子会与其结合，留下一小部分游离，而 IMA 不能与添加的钴结合，因为它在结合位点发生了修饰。 IMA 百分比升高会导致更多未结合的钴，这可以通过添加色谱试剂（例如二硫苏糖醇）进行检测，并通过光光谱法进行评估。 IMA的增加与钴的用量成反比，导致色积增加。 这是白蛋白钴结合试验、ACB 试验的基础。

IMA 已被研究作为心肌缺血的指标，但也发现在内皮功能障碍、感染和败血症患者中 IMA 增加。 在脑缺血、肺栓塞、深静脉血栓形成、心力衰竭、肠缺血等患者中也增加。IMA值在对照人群中呈正态分布，与年龄和性别无关。 IMA 是唯一达到临床评估水平的缺血生物标志物，无论受影响的器官组织如何，它都会在缺血发作后的几分钟内增加。

SuPAR（可溶性尿激酶纤溶酶原激活受体）是 uPAR 的可溶形式，uPAR 是一种主要在免疫系统细胞中表达的蛋白质，包括中性粒细胞、活化的 T 淋巴细胞和巨噬细胞。 uPAR 通过糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 与细胞膜结合。 当 uPAR 从细胞膜中释放出来时，它变成可溶性 (SuPAR)，可以作为一种稳定的蛋白质在各种生物体液中进行测量，例如血浆、尿液和脑脊液。 健康人的 SuPAR 水平在血液和尿液中相当稳定。 SuPAR 水平升高反映了免疫系统的激活，并已被评估为包括 COVID-19 在内的一些疾病中炎症和器官损伤的指标。 对 57 名 COVID-19 肺炎患者 SuPAR 浓度的研究表明，与未出现严重呼吸衰竭的患者相比，最终出现严重呼吸衰竭并需要机械通气的患者的 SuPAR 浓度更高。 更具体地说，大于或等于 6 ng/ml 的浓度具有 85.7% 的灵敏度来预测甚至在发生前 12 天的不良结果。 SuPAR 似乎是 COVID-19 患者的重要风险分层工具，因为它可以及早识别出将出现严重呼吸衰竭或需要机械通气的患者。

由于这是对 COVID-19 患者进行的第一项 IMA 研究，该研究的主要目的是调查 COVID-19 患者在入院时或症状出现后第 10 天（症状高峰期）的 IMA 水平是否会更高肺炎与健康人相比。 次要目的是评估 IMA 是否可以预测严重的呼吸衰竭和恶化风险，以及与 SuPAR 的结合是否会提高其准确性。

参加者：将包括 2 个研究小组：

i) 128 名确诊患有 COVID-19 疾病的患者（研究组，第 1 组） ii) 64 名没有任何排除标准的健康志愿者（对照组，第 2 组）呼吸衰竭 (PaO2/FiO2 <150mmHg) 和无严重呼吸衰竭 (PaO2/FiO2 >150mmHg) 进一步分为有或无恶化风险定义为需要高流量鼻插管、机械通气、入住 ICU 或死亡。

研究类型：这将是一项前瞻性观察研究，将在拉里萨大学总医院的肺科/Covid-19 部门进行。

功效分析：对于 90% 的统计功效，α 误差概率为 0.05 且第 1 组/第 2 组比率为 2:1，估计对照组（第 2 组）需要 64 人，对照组需要 128 人研究组（第 1 组）。

干预措施：将在入院时采集血样以测量 IMA 和 SuPAR 水平，并在症状出现（症状高峰期）后第 10 天采集血样以测量 IMA 水平。

血液样本采集：样本将采集在含有 K2EDTA 作为抗凝剂的血液采集管和分别用于 SuPAR 和 IMA 测定的血清分离凝胶管中。 在采样的前 3 小时内将样品离心（以 3000 x g 离心 10 分钟）。 然后，将血浆和血清样品置于 Eppendorf 管中并储存在 -80oC 下。

IMA 和 SuPAR 测量：IMA 水平将根据 ACB 测定的原理，使用市售的“缺血改良白蛋白测定试剂盒”方法（Abbexa LTD，Cambridge，UK），在 Architect c8000 自动分析系统（Abbott，美国）。 SuPAR 水平将通过 suPARnostic TurbiLatex 定量比浊免疫测定法（ViroGates A/S，丹麦）测定，也在 Architect c8000 自动分析系统上。

监测/记录：人口统计学（年龄、性别、国籍）、入院日期、合并症、用药、症状、生命体征（心率、体温、血压、呼吸频率、动脉血氧饱和度和 PaO2/FiO2 比值）、动脉血气体（PaO2、PaCO2、pH、HCO3）、乳酸、SARS-COV2 RT-PCR 的病毒载量以及成像和实验室测试的结果（血红蛋白、血细胞比容、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血小板、PT、入院时将记录 INR、aPTT、纤维蛋白原、d-二聚体、CRP、铁蛋白、LDH、肌钙蛋白、尿素、肌酐、AST、ALT、ALP、CPK、钾、钠、钙、总蛋白、白蛋白、总胆红素）。

生命体征（心率、体温、血压、呼吸频率、动脉血氧饱和度和 PaO2/FiO2 比值）、实验室检查结果（如上所述）和是否存在任何并发症（肺炎、ARDS、肺栓塞、中风、急性肾病衰竭、多器官功能衰竭、心律失常、休克、伪膜性结肠炎等）每日记录。

预期结果：i) 与健康志愿者相比，COVID-19 患者的 IMA 水平预计更高 ii) 预计会发生严重呼吸衰竭或有恶化风险的患者入院时的 IMA 水平更高 iii) IMA 水平在症状出现后第 10 天，严重呼吸衰竭患者的 SuPAR 水平预计会更高，并能更准确地预测恶化风险 iv) 与健康志愿者相比，COVID-19 患者的 SuPAR 水平预计会更高 v) 入院时的 SuPAR 水平是预计会发生严重呼吸衰竭或有恶化风险的患者会更高 vi) IMA 和 SuPAR 的组合，预计会提高 SuPAR 的预测准确性

据我们所知，这将是第一项针对 COVID-19 患者进行的缺血修饰白蛋白研究。 预后是临床决策的关键驱动力。 如果 IMA 水平与不良预后之间的相关性得到证实，它将成为 COVID-19 患者风险分层的有用工具。 此外，缺血生物标志物（如 IMA）与炎症生物标志物（如 SuPAR）的组合可能是该方法的关键。