Sinonazální dutina jako rezervoár pro bakteriální rozvoj horních dýchacích cest

Studium dynamiky mikrobiální komunity je kriticky důležité pro lidské zdraví, včetně toho, jak udržet nebo obnovit zdravý mikrobiom. Metagenomické studie způsobily revoluci v mikrobiologii tím, že tyto problémy řešily způsobem nezávislým na kultuře a definovaly zásadní role mikrobioty při vývoji hostitele. Počáteční vývoj střevní mikroflóry začíná in utero a je silně ovlivněn expozicí při narození (např. vaginální vs porod císařským řezem). Předpokládá se, že počáteční výsev mateřskou mikroflórou a následná bakteriální sukcese mají zásadní dlouhodobé dopady na lidské zdraví. Nedávné longitudinální studie dokumentovaly postupný nárůst bakteriální diverzity, nenáhodné shromažďování komunit, účinky mateřského mléka a zavedení konzumních potravin a velké taxonomické posuny v důsledku antibiotik a environmentálních stresů, ke kterým dochází během kojeneckého věku. Vzhledem k tomu, že poruchy těchto časných událostí byly spojeny s cukrovkou, rakovinou, duševním zdravím a řadou dalších nemocí, probíhají snahy zjistit, jak se manipulace s dětským mikrobiomem do „zdravého“ stavu promítá do dlouhodobých klinických výsledků.

Naopak malá pozornost byla věnována faktorům, které řídí vývoj mikroflóry dýchacích cest v raném věku, včetně dutiny ústní. Při narození se orální a nasofaryngeální flóra podobá flóry mateřského vaginálního traktu nebo kůže (v závislosti na způsobu porodu). Předběžné soubory dat naznačují, že během prvního roku života se mikrobiom dýchacích cest vyvine v bohatý mikrobiální ekosystém podobný dospělým. Předpokládá se, že základní kolonizátoři dýchacích cest podmiňují následnou kolonizaci více než 600 druhy, z nichž některé slouží k vytvoření robustních bakteriálních společenství charakteristických pro lidské zdraví. Další sekundární kolonizátoři se často podílejí na infekcích úst a dýchacích cest, včetně chronické sinusitidy, zápalu plic a periodontálních onemocnění. Například kolonizace kojenců Streptococcus pneumoniae je důležitým rizikovým faktorem dětského onemocnění středního ucha. Raná mikrobiální společenství proto představují hlavní faktory, které řídí kolonizaci dýchacích cest patogenními i ochrannými mikroby během vývoje dětského mikrobiomu. Pochopení akvizice dětských mikrobiálních komunit dýchacích cest a faktorů, které mění jejich složení, je zásadní pro podporu lidského zdraví a prevenci onemocnění dýchacích cest, které představují každoroční mnohamiliardovou zátěž pro systém zdravotní péče v USA.

Zatímco výměna mikroflóry dýchacích cest mezi matkou a novorozencem je dobře zdokumentována, žádné studie nezkoumaly vztahy mezi jednotlivými subjekty mezi ústy, dutinami, nosohltanem a plícemi a relativní četnost bakteriálních taxonů na těchto místech. Nedávné důkazy naznačují, že dutina ústní může sloužit jako rezervoár pro patogeny, které se přemisťují do neorálních lokalit; mikroby asociované s ústním podáním infikují většinu ostatních míst v těle, což dokazuje sekvenování 16S. Dvě upozornění však činí tuto bakteriální metastázu kontroverzní. Za prvé, že ústní bakterie se nenacházejí pouze v ústech, ale nacházejí se také jinde v dýchacích cestách, je obtížné určit jejich původ. Není tedy známa směrovost mikrobiální výměny mezi mezerami v dýchacích cestách. Za druhé, většina průzkumů 16S ribozomální RNA (rRNA) odhaluje pouze bakteriální složení na úrovni rodu nebo kmene, což poskytuje málo informací o kmenových liniích a o tom, zda mohou jednotlivé kmeny migrovat mezi místy. Tato data jsou kritická pro podporu rozvoje ochranné mikroflóry a zároveň omezování růstu odolných patogenů.

Kompletnější pochopení tohoto obchodování začíná hloubkovými průzkumy na úrovni kmenů bakteriálních komunit přítomných v každém výklenku dýchacích cest krátce po narození a jejich vývojem v průběhu času. Jako krok tímto směrem bude tato studie sponzorovaná Academic Health Center používat metagenomické sekvenování k posouzení výměny specifických bakteriálních kmenů v horních cestách dýchacích. Naše studie na myších (vysvětlené jinde) budou doplněny studií kojenců s cystickou fibrózou (CF), kteří představují jedinečnou populaci, která usnadňuje zachycení orální, sinonazální a plicní mikroflóry během prvních dvou let života. Použitím kombinace ústních výtěrů a výtěrů z krku spolu s nasálním odsáváním vzorků hlenu bude k charakterizaci složení bakteriálních komunit na každém anatomickém místě použit přístup metagenomického sekvenování. Počínaje narozením budou vyšetřovatelé shromažďovat časové řady výtěrů od každého subjektu a sledovat změny ve vývoji mikrobioty v průběhu času. Tím naše studie osvětlí obchodování s prospěšnými i patogenními mikroby v dýchacích cestách a mohou představovat zásadní patofyziologický krok k posunu rovnováhy mezi zdravím dýchacích cest a nemocí.

EXPERIMENTÁLNÍ PLÁN Vývoj bakteriálních komunit v dýchacích cestách bude sledován v malé kohortě pacientů s CF. Vzhledem k tomu, že kojenci s CF jsou monitorováni od narození a jsou rutinně odebírány vzorky na mikroflóru dýchacích cest během rutinních ambulantních návštěv jako součást jejich standardní péče, představují jedinečnou populaci pro sledování přenosu bakterií mezi dutinou ústní, nosní a plicní. Všichni novorozenci na University of Minnesota (UMN) jsou geneticky vyšetřeni. Ti, kteří mají pozitivní test na CF, budou potvrzeni pomocí pilokarpinového potního testu. Pozitivní subjekty (se 2 mutacemi regulátoru transmembránové vodivosti cystické fibrózy [CFTR]) budou poté odebrány během návštěv účastníků v centru pro léčbu CF; v průměru budou kojenci sledováni každý měsíc po dobu prvních 6 měsíců, každý druhý měsíc až do 1 roku věku, poté budou následovat čtvrtletní návštěvy v centru UMN CF (v souladu s pokyny Nadace pro cystickou fibrózu). V rámci standardní péče se při každé návštěvě odebírají nosní vzorky odsáváním. Nylonové tampóny budou také použity k odběru vzorků bukální sliznice každého kojence. Budou také získány orofaryngeální výtěry, které jsou považovány za přesné zástupce mikrobiomů dolních dýchacích cest (plic). Na základě počtu novorozenců s CF očekávaným v průběhu studie plánují vyšetřovatelé rekrutovat až 10 subjektů. Od každého kojence bude odebráno až 10 dočasných výtěrů z každého místa dýchacích cest (10 kojenců x 10 výtěrů x 3 místa = 300 vzorků). Výtěry budou uloženy ve fyziologickém roztoku, zmraženy na -80 °C a zpracovány paralelně.

Z každého vzorku výtěru bude extrahována DNA a sekvenování bude provedeno v Genomickém centru University of Minnesota.