Diagnostické inovace pro dětskou tuberkulózu v Bolívii

Populace pediatrických subjektů, zařazení a sledování: Během prvních dvou let studie bude na 18 měsíců nabírána „testovací populace“, aby se stanovily kvantitativní standardy cfDNA a rozmezí pro každou skupinu klinických výsledků, aby se vyhodnotily prediktivní hodnoty pro cfDNA hladiny jako biomarker klinického výsledku. Budeme charakterizovat dynamiku hladin cfDNA v periferní krvi u dvou věkových skupin dětí (2 měsíce-6 let ["mladší děti"], 7-14 let ["starší děti"]). Stratifikovaná analýza s těmito podskupinami založenými na věku je logická, protože výtěžnost diagnostického testu a klinické projevy jsou v těchto skupinách odlišné.

Pro Cíl 2 během let 3-4 studie bude na 18 měsíců nabrána "validační populace" pro validaci kvantitativních standardů cfDNA a rozsahů pro každou skupinu klinických výsledků. Nábor subjektů, informovaný souhlas, sběr dat a studijní skupiny pro analýzu budou stejné jako pro "testovanou populaci" ve specifickém cíli č. 1. Subjekty v každé studijní skupině budou stratifikovány do podskupin podle věku (2 měsíce-6 let, 7-14 let). Sériové hladiny cfDNA budou hodnoceny a charakterizovány u dětí ve skupinách s potvrzenou a nepotvrzenou TBC, aby se potvrdila normalizace hodnot cfDNA účinnou anti-TB terapií.

Tabulka 1. Časová osa projektu

Počáteční registrace a odběr dat/vzorků bude proveden před zahájením léčby TBC v nemocnici nebo na klinice. Kritéria zařazení: Děti ve věku od 2 měsíců do 14 let identifikované prostřednictvím klinik a nemocničních oddělení „Dr. Mario Ortiz Suarez“ Dětská nemocnice v Santa Cruz a prezentující se k vyhodnocení symptomatického respiračního onemocnění a podezření na tuberkulózu bude způsobilá k zápisu (kritéria pro zařazení založená na pokynech bolivijského ministerstva zdravotnictví pro podezření na tuberkulózu u dětí). Po screeningu na vylučovací kritéria (předchozí léčba TBC v minulém roce, současná léčba prevence TBC, hmotnost < 2,5 kg nebo klinická nestabilita, pozitivní diagnostický test COVID-19) pracovníci studie předloží studii ústně rodičům a poskytnout brožuru s podrobnějšími informacemi určenou pro rodiče i starší osoby. Bude získán informovaný souhlas rodičů a souhlas pediatrického účastníka. Studie bude zahrnovat odběr vzorků pro diagnostické testování a klinická data, jak je uvedeno níže, ale rozhodnutí o léčbě tuberkulózy bude činit ošetřující lékař, který není zapojen do studie. Protože studijní skupiny pro analýzu dat jsou určeny částečně na základě výsledků provedených diagnostických testů a klinické odpovědi na léčbu, nebudou subjekty zařazeny do studijních skupin při zápisu. Zařazení do studijní skupiny (potvrzená TBC, nepotvrzená TBC a nepravděpodobná TBC) určí biostatistik projektu poté, co subjekt dokončí všechny studijní aktivity (kritéria a velikost vzorku podle skupin viz D.5. a D.7. přiřazení studijní skupiny) . Vzhledem k tomu, že bolivijské směrnice pro dětskou tuberkulózu umožňují klinické hodnocení dětí s respiračním onemocněním a pouze s několika kritérii souvisejícími s tuberkulózou, tato náborová strategie zahrne populaci pacientů s podezřením na tuberkulózu, což nám umožní porovnat výsledky v „případech tuberkulózy“ (potvrzeno TBC a nepotvrzená TBC) a u nemocných pacientů, kteří nesplňují definice případů NIH pro nepotvrzenou TBC (tj. skupina s nepravděpodobnou TBC, viz D7). Tato nepravděpodobná skupina TBC bude sloužit jako „kontrola nemocných/respiračních onemocnění“, odděleně od skupiny „kontroly dobře“. Každý týden budou z komunitních zdravotnických klinik také přijímáni dobře kontrolní subjekty bez respiračních symptomů a věkově (+ 2 roky) s podezřením na TBC. Kontroly studní budou mít pouze jednu sadu vzorků a žádné invazivní vzorky.

D.4. Zaměstnanci studie Bolívie: Nábor účastníků studie a činnosti odběru vzorků bude řídit koordinátor studie lékaře, pod dohledem spoluřešitele Dr. Ramiro Cabrera, dětského pneumologa a regionálního konzultanta pro dětskou tuberkulózu v Santa Cruz. Na klinické aktivity a aktivity související s pacienty budou dále dohlížet PI Richard Oberhelman (specialista na dětské infekční choroby) a Robert Gilman (specialista na ID), stejně jako specialisté na ID Jeffrey Tornheim a ředitel závodu Prisma se sídlem v Limě Carlton Evans.

D.5. Primární výsledky, statistická síla a velikost vzorku Primárním výsledkem pro Cíl 1 jsou hladiny cfDNA pro a) děti s potvrzenou a nepotvrzenou TBC ("případy TBC"), b) děti s nepravděpodobnou TBC (UTB) a c) zdravé děti ( TOALETA). Na základě předběžných údajů byly průměrné hladiny cfDNA (a standardní odchylky) pro tyto skupiny 4,2 (4,0), 2,0 (3,2) a 1,1 (0,03). Předpokládáme, že děti s TBC budou mít významně vyšší sérové ​​koncentrace cfDNA než skupiny UTB a WC. Statistická síla a velikost vzorku: Při oboustranné chybě I. typu je nastavena na 0,05, statistická síla je nastavena na 80 %, k detekci významného rozdílu mezi dětmi s TBC a UTB je zapotřebí 42 subjektů na skupinu (na základě vzorců Hulleyho et al.). Srovnání mezi skupinou TBC a WC vyžaduje 13 dětí na srovnávací skupinu. Na základě údajů ze současných studií a místního ministerstva zdravotnictví (viz D.7. níže) předpokládáme 135 případů TBC ročně (55 za 2 měsíce-6 let; 80 za 7-14 let), neboli přibližně 200 případů TBC za 18měsíční období studie (pro testovanou populaci a validační populaci). Předpokládáme také 80 nepravděpodobných případů TBC za rok (40 za 2 měsíce-6 let: 40 za 7-14 let) nebo přibližně 105 nepravděpodobných případů TBC za 18měsíční období studie (každý 18 měsíců pro testovanou populaci a validační populaci nábor). Subjekty budou stratifikovány do dvou věkových skupin (2 měsíce-6 let, 7-14 let). Se 42 požadovanými případy TBC na věkovou skupinu náš navrhovaný vzorek překračuje minimální požadavky o 50 % nebo více na věkovou skupinu. Zde uvedené cíle pro zápis poskytnou flexibilitu při plnění náborových cílů a míry nereagování.

D.6. Postupy a odběr vzorků. U hospitalizovaných pacientů s podezřením na tuberkulózu se zápis, klinické hodnocení a odběr vzorků provádějí ve stejné místnosti; u ambulantních pacientů bude proces klinického hodnocení, odběr žaludečního aspirátu proveden v poradně Pneumologické kliniky dětské nemocnice a odběr krve v klinické laboratoři flebotomie. Následný odběr vzorků bude probíhat prostřednictvím komunitních klinik, kde pacienti dostávají svůj týdenní příděl léků na TBC, s následnými kontrolami 1 a 2 týdny po zahájení léčby. Je naplánována 2měsíční kontrolní návštěva ve spojení s rutinní návštěvou lékaře, aby bylo možné později sledovat vzorek biomarkeru cfDNA.

Všichni účastníci hodnocení pro TBC budou mít v době zápisu postupy včetně:

• Lékařská anamnéza a klinické hodnocení potřebné k přesnému posouzení každého kritéria, které přispívá k jejich následnému přiřazení k výsledným skupinám TBC, na základě revidovaných kritérií konsenzu z roku 2015.
• Testování Quantiferon-TB Gold In-Tube k detekci imunologických důkazů tuberkulózy (včetně latentní infekce [LTBI]) bude provedeno v naší laboratoři na Universidad Catolica na základě standardních protokolů
• Sérologie HIV, pokud není známo, že je HIV+, od společnosti Abbott Alere Určete HIV 1/2 (analytické úpravy sérostatu HIV viz D.8 Analýza dat)
• COVID-19 PCR nebo test antigenu – pouze pacienti s podezřením na TBC. (Pokud je kladné, tyto subjekty jsou vyloučeny)
• Rentgenový snímek hrudníku – pouze pacienti s podezřením na TBC; neprovádí se na dobře kontrolách. AP a boční pohledy. Digitální snímky zpracované v DICOM budou přeneseny do laboratoře Dr. Zimice k analýze.
• Ultrazvuk plic – pouze pacienti s podezřením na TBC; Neprovádí se u kontrol studní. Ultrazvukové vyšetření se provádí na základě standardního protokolu pod vedením Dr. Fentressa, zobrazení hrudníku v kolmých rovinách ve střední klavikulární linii vpředu a vzadu od apices k bránici a ve střední axilární linii od axily k bránici, celkem 12 zobrazení za účastník. , ,
• Odběr vzorků pro mikrobiologii TBC a PCR – pouze pacienti s podezřením na TBC; neprovádí se na dobře kontrolách. Všem subjektům se zpracováním na podezření na TBC budou odebrány alespoň tři vzorky ekvivalentní sputu pro mikrobiologii TBC a PCR analýzu pomocí Xpert MTB/RIF. Přijatelné vzorky zahrnují (1) žaludeční aspiráty, (2) expektorované sputum (pro starší subjekty, které mohou produkovat sputum) nebo (3) vzorky pro řetězcové testy, prováděné podle našeho standardního protokolu. Vzorky budou odebírány brzy ráno před jídlem a doba odběru vzorků bude oddělena minimálně 24 hodinami. V případech, kdy rodiče nebo ošetřující lékaři souhlasí pouze se dvěma vzorky, třetí vzorek nebude odebrán. Léčba proti TBC bude zahájena, když to bude indikováno lékařem po odběru posledního vzorku pro mikrobiologii TBC.
• Mikrobiologická analýza pro izolaci a detekci TBC bude provedena na vzorcích odebraných pacientům s podezřením na TBC, včetně (1) Ziehl-Neelsen AFB stěru, (2) kultivace TBC a (3) detekce TBC PCR pomocí Xpert MTB/RIF. Kultury TBC budou používat techniku ​​MODS, kterou jsme vyvinuli v Peru 8, 10
• Sérum pro cfDNA odebrané venepunkcí. Všechny vzorky séra cfDNA posíláme do Tulane společností World Courier na suchém ledu a všechny vzorky rozdělujeme alikvotně, takže polovina bude odeslána a druhá polovina uložena při -80 C.

Účast subjektů kontroly studní bude ukončena po odběru a vyhodnocení zapsaných vzorků. Léčba TBC bude zahájena u všech subjektů s předpokládaným onemocněním TBC na základě klinického názoru ošetřujícího lékaře a na základě bolivijských národních standardů léčby TBC. Účastníci studie s kompatibilním onemocněním a na anti-TB terapii budou mít následující postupy uvedené v určených časech:

• Klinické hodnocení (1 týden, 2 týdny a 2 měsíce po zařazení a zahájení léčby)
• Sérum pro cfDNA a plnou krev pro CBC (1 týden, 2 týdny a 2 měsíce po registraci)
• Pro subjekty na antituberkulózní terapii, které nevykazují zlepšení – opakujte hodnocení (podle rozhodnutí lékaře 2 týdny nebo 2 měsíce po zařazení). Minimálně 2 vzorky pro nátěr, kultivaci a Xpert MTB/RIF (žaludeční aspiráty [intubací/provázkovým testem] nebo sputa)

Techniky kultivace TBC. Odebrané vzorky budou kultivovány na M. tuberculosis pomocí metody mikroskopického pozorování lékové citlivosti (MODS). Standardní objemy každého dekontaminovaného vzorku budou naočkovány do modifikovaného média Middlebrook 7H9 a kultivovány na sterilní 24jamkové destičce. Destičky se umístí do plastového znovu uzavíratelného sáčku, inkubují se při 37 °C a zkoumají se každý druhý den po dobu až 30 dnů mikroskopií s obráceným světlem. Předpokládané izoláty TBC s pupínky jsou hlášeny jako pozitivní a potvrzeny pomocí IS 6110 PCR.

Testy CRISPR-TBD: Cirkulující cfDNA bude extrahována pomocí Quick-cfDNA Serum & Plasma v Hu lab v Tulane. CRISPR-TBDB vyžaduje cílovou amplifikaci založenou na PCR před produkcí fluorescenčního signálu zprostředkovaného CRISPR, podle postupů nedávno publikovaných Huang et. al. 23 Data CRISPR-TBDB budou vyhodnocena in silico analýzou pomocí softwaru SnapGene (verze 5.0.8) a trojnásobným stanovením CRISPR-TBDB.

Rentgenový snímek hrudníku a ultrazvukové vyšetření plic a zpracování dat. Viz konkrétní cíl č. 3 níže.

D.7. Zadání studijní skupiny. Použijeme design pozorovací studie s 5 studijními skupinami dětí ve věku od 2 měsíců do 14 let, jak je podrobně popsáno níže. Jedná se o A) potvrzenou plicní TBC, B) nepotvrzenou plicní TBC, C) nepravděpodobnou TBC, D) věkově odpovídající kontroly (které budou rozděleny do 2 skupin na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti LTBI). Většina dětí, u kterých byla hodnocena TBC a u kterých byla zahájena léčba podle rozhodnutí ošetřujícího (nestudovaného) lékaře, bude spadat do skupin A (přibližně 10 %) a B (60–65 %) na základě posledních údajů. Skupiny A a B společně jsou zde označovány jako "případy TBC". Přibližně 25–30 % subjektů, které splňují vstupní kritéria založená na bolivijských směrnicích, ale nesplňují definici pokynů NIH z roku 2015 pro potvrzené nebo nepotvrzené, bude zahrnuto do skupiny C (nepravděpodobná TBC), která bude sloužit jako srovnávací skupina „jiné respirační onemocnění“. Odhadovaná způsobilá populace je založena na datech z probíhající studie R21 (pro děti ve věku 0-5 let) a na datech Ministerstva zdravotnictví. Kritéria pro každou studijní skupinu a odhadovaný počet na skupinu, která má být přijata za rok během období zápisu předmětů, jsou:

A. Potvrzená TBC – odhadem 65 subjektů ročně (15 za 2 měsíce - 6 let; 50 za 7 - 14 let), definovaných jako:

• Symptomatická při počátečním zařazení, definovaná na základě definice klinického případu z 2015 NIH Consensus Expert Panel 22 (Quantiferon Gold pozitivní nebo negativní).
• Pozitivní kultura M. tuberculosis nebo pozitivní Xpert MTB/RIF z alespoň jednoho biologického vzorku.

B. Nepotvrzená TBC odhadem 80 subjektů za rok (40 za 2 měsíce - 6 let; 30 za 7 - 14 let) definovaných jako:

• Symptomatické při zařazování a klinickém/radiografickém vyhodnocení v souladu s TBC, na základě definice klinického případu z roku 2015 NIH Consensus Expert Panel 22 (Quantiferon Gold pozitivní nebo negativní).
• Negativní kultura M. tuberculosis a negativní Xpert MTB/RIF ze všech biologických vzorků.

C. Nepravděpodobná TBC --- 80 subjektů ročně (40 za 2 měsíce - 6 let; 40 za 7 - 14 let), definovaných jako:

• Symptomatické při zařazování, ALE klinické/radiografické hodnocení NESPŇUJE kritéria pro nepotvrzenou TBC, podle klinické definice-2015 Expertní panel 22 (Quantiferon Gold pozitivní nebo negativní).
• Negativní kultivace M. tuberculosis a negativní Xpert MTB/RIF ze všech vzorků. D. Kontrolní skupina dětí studny – jedna pro každé dítě ve skupinách A-C výše, věk odpovídá párovému případu.
• Dobře děti, které mají jiné příčiny než respirační onemocnění a nemají příznaky TBC.
• Klinické a radiografické vyšetření (pokud bylo provedeno) NEVYHLEDÁVÁ na TBC a NENÍ diagnostikováno ani léčeno na TBC během období sledování (minimálně 8 týdnů).
• Rozděleno do 2 podskupin na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti LTBI (testem Quantiferon Gold).

D.8. Analýza dat. Subjekty budou v době analýzy dat na základě výsledků diagnostických testů roztříděny na „potvrzenou“, „nepotvrzenou“ a „nepravděpodobnou“ TBC na základě výsledků diagnostických testů a klinického vývoje. Vzhledem k tomu, že většina dětí mladších 7 let s onemocněním TBC nemá kultivaci nebo Xpert potvrzení a nepotvrzené případy TBC jsou pro epidemiologické účely považovány za skutečné případy, budou tyto skupiny také pro analýzu kombinovány jako „případy TBC“. Subjekty v každé studijní skupině budou stratifikovány do podskupin podle věku (2 měsíce-6 let, 7-12 let). Pro exploratorní analýzy budou provedeny další podskupiny založené na sérostatu HIV, včetně subjektů HIV+ i bez nich (séroprevalence HIV je u dětí v této populaci extrémně nízká, takže dopad stavu HIV bude pravděpodobně minimální). Pohlaví bude ve všech analýzách považováno za nezávislou proměnnou. Kromě toho bude pohlaví zahrnuto jako interakční termín proti všem primárním prediktorovým proměnným (doba pozorování, hladina cfDNA). Sériové hladiny cfDNA budou hodnoceny a charakterizovány u dětí ve skupinách s potvrzenou a nepotvrzenou TBC. Replikované hodnoty cfDNA budou standardizovány modelováním jejich průměrných hodnot proti odpovídajícím koncentracím pomocí čtyřparametrových logistických regresních modelů. Mann Whitney U testy budou použity pro testování hypotéz srovnávající skupinu případů TBC se třemi srovnávacími skupinami (děti s nepravděpodobnou TBC, zdravé děti s LTBI a zdravé děti bez LTBI). Průzkumné analýzy budou porovnávat výsledky (úroveň cfDNA, skóre rizika TBC) mezi skupinou „zlatého standardu“ potvrzené TB (kultivace nebo Xpert MTB-RIF pozitivní) a nepotvrzenou (kultura a Xpert negativní) skupinou. Bonferroniho korekční faktor bude použit pro zohlednění vícenásobného testování ve vrstvách věkové skupiny.

Pro analýzu reakce na léčbu (Specifický cíl 2) je pozitivní odpověď definována podle konsenzuálního dokumentu s definicemi klinických případů z roku 2015, měřeno po 1 týdnu, 2 týdnech a 2 měsících. po registraci, buď:

a) Odpověď na antituberkulózní léčbu: klinické příznaky naznačující tuberkulózní onemocnění, které byly přítomny na začátku studie, se zlepšily a neexistuje žádný nový klinický rys naznačující tuberkulózu; NEBO (b) Žádná odpověď na antituberkulózní léčbu: klinické příznaky naznačující tuberkulózní onemocnění, které byly přítomny na začátku studie, se nezlepšily nebo se zhoršily.

Analytickým cílem je porovnat rozdíly v odpovědích v hladinách cfDNA v průběhu času. Zobecněné odhadovací rovnice (GEE) budou použity k modelování reakce na léčbu v závislosti na době pozorování a hladině cfDNA. Do modelu GEE bude zahrnut interakční člen, aby se otestovalo, zda se časové vzorky v hladinách cfDNA liší podle typu odpovědi. Pro srovnání hladin cfDNA mezi skupinami odpovědí v každém časovém bodě budou provedena párová srovnání. K zohlednění chybějících následných dat budou použity vážené modely GEE. K posouzení doby do pozitivní léčebné odpovědi budou použity Kaplan Meierovy křivky, včetně léčebné odpovědi jako cenzorové proměnné a vynesené proti hladinám cfDNA (klasifikovaných do tertilů) v průběhu času.

D.9 Specifický cíl č. 3: Určit korelaci mezi hladinami cfDNA a kvantitativními biomarkery skóre rizika onemocnění TBC stanovenými (1) rentgenovým snímkem hrudníku, měřeným počítačově podporovanou analýzou, a (2) ultrazvukem plic, provedeným s přenosným/nízkým - nákladová sonda as pomocí algoritmů strojového učení pro automatickou interpretaci bez potřeby radiologa. Tyto biomarkery budou testovány jako potenciální kofaktory, které se mohou kombinovat s hladinami cfDNA v periferní krvi, aby se zlepšila detekce onemocnění TBC u dětí. Jako sekundární cíl budeme zkoumat nálezy na rentgenovém snímku hrudníku a ultrazvuku plic pomocí algoritmů umělé inteligence pro interpretaci, abychom prozkoumali potenciální souvislosti mezi cfDNA a zobrazovacími biomarkery. Skutečnost, že zobrazovací nálezy jsou nejkonkrétnějším dostupným důkazem onemocnění mezi mnoha „měkkými“ diagnostickými kritérii, potvrzuje tuto průzkumnou analýzu navzdory omezené citlivosti a specifičnosti. Pokud přítomnost plicní patologie u dětí s TBC koreluje s hladinou cfDNA, bylo by to zjištění s nesmírnou klinickou užitečností pro zdravotníky v zemích s nízkými a středními příjmy. Interpretace rentgenových snímků hrudníku je však pravděpodobně nejnáročnější složkou diagnostických kritérií TBC, protože vyžaduje sofistikované, drahé vybavení a odborný personál, jak techniky pro sběr dat, tak zdravotníky pro interpretaci. Navrhujeme mnohostranný přístup k analýze zobrazovacích dat, využívající dva nekonvenční přístupy, které jsou podporovány v lékařské literatuře, tj. 1) ultrazvuk plic jako bezradiační alternativu k rentgenovému snímku hrudníku, který je obecně přenosnější, s několika nízkými náklady, přenosné platformy; a 2) využití automatizované interpretace jak rentgenových snímků hrudníku, tak LUS pomocí technologie strojového učení počítačově podporovaného designu (CAD). Z několika CAD technologií uváděných na trh pro interpretaci rentgenových snímků hrudníku u pacientů s tuberkulózou ve věku 15 a více let je pouze jedna rozsáhle validována a certifikována CE v Evropské unii pro použití u dětí ve věku od 4 let – platforma Delft Imaging CAD4TB. , , CAD4TB zpracovává snímky DICOM rentgenovým snímkem hrudníku, aby vytvořil skóre od 0 do 100 pro posouzení pravděpodobnosti aktivní TBC, stejně jako snímek tepelné mapy k označení řezů plic s patologií související s TBC (viz obr. 7). Software CAD4TB a technickou podporu pro tuto studii poskytne společnost Delft Imaging (viz dopis podpory). Kromě toho bude Dr. Mirko Zimic používat přístupy strojového učení používané k vývoji algoritmů pro dětskou pneumonii společností LUS k vývoji podobné strategie pro dětskou TBC. Jak platforma CAD4TB, tak algoritmus Zimic LUS vytvoří skóre rizika TBC, které lze porovnat s interpretacemi radiologů, a jak skóre rizika založené na AI, tak tradiční skóre rizika budou korelovány s úrovněmi cfDNA.

Všechna ultrazvuková skenování budou prováděna vyškoleným personálem pomocí General Electric VIVID i BT12 s vysokofrekvenční lineární sondou. Sonograf zaznamená přítomnost a lokalizaci abnormálních ultrazvukových nálezů podle Fentress et. al. 16 Zaznamenáme alespoň jedno video z každého sonografického pohledu, abychom umožnili externí kontrolu po skenování, pro alespoň 12 ultrazvukových videí na účastníka.

D. 10. Interpretace a analýza zobrazení: Výsledky rentgenového snímku hrudníku budou zaznamenány ve dvou formátech:

1. Rentgenové snímky budou nezávisle přezkoumány dvěma pediatrickými radiology, kteří zaznamenají přítomnost nebo nepřítomnost specifických nálezů naznačujících PTB, jak je definoval panel odborníků z roku 2015. 22 Tyto nálezy zahrnují lymfadenopatii, opacifikaci vzdušného prostoru, uzliny a pleurální výpotky. Zprávy od radiologů budou porovnány, aby se určila kongruence s "v souladu s tuberkulózou" podle klinických kritérií pro rok 2015. V případech, kdy je stanovení nesouhlasné, provede rozhodnutí třetí radiolog. Radiologové zaznamenají nálezy a závažnost na základě standardní stupnice, aby vytvořili skóre rizika pro analýzu.
2. Snímky DICOM budou vyhodnoceny pomocí programu CAD4TB v7 za použití publikovaných postupů, aby se vygenerovalo skóre rizika TBC a obraz plicní tepelné mapy.

Konvenční skóre RTG hrudníku je určeno počtem nálezů zkontrolovaných jako pozitivní (z celkového počtu n = 8 možných nálezů) na základě šablony CXR z konsenzuálního papíru NIH. CAD4TB je trénován na nezávislých anotovaných souborech dat, aby rozpoznával rysy TBC, a poskytuje skóre 0-100, které označuje pravděpodobnost TBC. Je také generována teplotní mapa abnormality, která označuje oblasti plic detekované jako abnormální. Plán analýzy zahrnuje tři faktory: konvenční rentgenové nebo CAD4TB skóre (proměnná ordinální odpovědi), čas pozorování a úroveň cfDNA. Analytickým cílem je testovat významné rozdíly mezi hodnotami skóre CAD4TB a hladinami cfDNA v průběhu času. GEE se použije k modelování skóre CAD4TB v závislosti na čase a úrovni cfDNA. Termín interakce bude použit k testování, zda se časové trendy v hladinách cfDNA liší podle skóre CAD4TB. Párová srovnání budou použita k testování významných rozdílů mezi hladinami cfDNA a skóre CAD4TB v každém časovém bodě. K zohlednění chybějících následných dat budou použity vážené modely GEE. 31

Výsledky ultrazvuku plic (LUS) budou podobně hodnoceny jak konvenčními, tak automatizovanými přístupy strojového učení. Všechny uložené ultrazvukové snímky budou zkontrolovány odborníkem na ultrazvuk plic, který je zaslepený klinickými údaji účastníka. Pokud dojde k neshodě mezi interpretací terénního sonografa a zaslepeným odborníkem na LUS, bude to posouzeno druhým zaslepeným ultrazvukovým odborníkem. Obrazy LUS budou vizuálně posouzeny a klasifikovány jako pozitivní nebo negativní na TBC na základě nálezů plic definovaných panelem odborníků z roku 2015 pro rentgenové snímky hrudníku aplikované na LUS. Umělá konvoluční neuronová síť (CNN) založená na ultrazvukových snímcích plic bude trénována pro predikci TBC metodami dříve publikovanými Zimic et. al.,22,23 podle zlatého standardu klasifikace na základě kritérií NIH a rentgenových snímků hrudníku. V předchozích studiích jsme vyvinuli CNN pro rozpoznávání TBC v kulturách MODS, které dosáhly 96% přesnosti, 96% senzitivity a 96% specificity, což dokazuje, že CNN by mohly pomoci nebo nahradit personál pro automatizovanou diagnostiku TBC.22, 23 Školení navrhovaná CNN bude provedena pomocí rámců Caffe a Tensorflow kvůli jejich rychlosti a modularitě. Systém bude vyvíjen v Pythonu s použitím knihoven OpenCV v kroku detekce. Každý snímek každého videa LUS bude odborníkem ručně označen, aby určil, zda má známky lézí TBC. Použijeme model varianty LeNet CNN, který se bude opírat o dvě konvoluční vrstvy, z nichž každá následuje po sdružovacích operacích, jako je dílčí vzorkování, které bude odpovídat za neměnnost překladu. Očekává se, že kombinace výše uvedených vrstev poskytne celkem 60K naučitelných parametrů. Očekává se, že v prvních dvou letech bude zapsáno přibližně 280 dětí, z nichž každé bude mít 1minutová videa extrahovaná z LUS rychlostí 30 snímků za sekundu (1800 snímků), budeme mít celkem 504 000 snímků. Při použití standardního rozšiřování dat očekáváme, že budeme mít alespoň obrázky 4x106 pro adekvátní školení CNN. Vícenásobné logistické regresní analýzy budou použity k modelování zlatého standardu klasifikace TB TB, včetně jako prediktorů hladiny cfDNA a ultrazvukového skóre CNN, přizpůsobené věku a pohlaví.

Analýza LUS bude provedena s metodikami podobnými těm, které se používají pro CXR, přizpůsobené pro výsledky založené na LUS. Skóre LUS bude upraveno z konsenzuálního dokumentu NIH pro CXR a bude sestávat z kombinace kvantitativního počtu nálezů označených jako pozitivní (z celkového počtu n=5: konsolidace, malá subpleurální konsolidace, dutina, pleurální výpotek a miliární obrazec ) a počet a umístění abnormálních oblastí plic začleněných do modelu logistické regrese. LUS bude také interpretován jako „konzistentní s TBC“ nebo „nekonzistentní s TBC“, na základě stejných kritérií používaných pro CXR v konsenzuálním dokumentu NIH. Přístup založený na GEE popsaný výše pro CXR bude také aplikován na analýzu dat LUS.