Tutkimus metabolomiikan ja ahdistuksen sekä masennuksen välisestä yhteydestä bronkiektasiassa

Kystisen fibroosin ulkopuolinen bronkiektasia on yleinen keuhkosairaus. Toistuvat bronkiektasian akuutit pahenemiset voivat vaikeuttaa pahasti keuhkotoimintaa, kiihdyttää keuhkokapasiteetin laskua, heikentää elämänlaatua ja lyhentää elinikää. Vaikka aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet tekijöitä, kuten heikentyvä keuhkotoiminta ja Pseudomonas aeruginosa -infektio, jotka vaikuttavat akuutteihin pahenemisiin, näiden tekijöiden poistaminen ei täysin estä tällaisia jaksoja bronkiektasiapotilailla. Nykyinen tutkimus viittaa siihen, että 20–40 % bronkiektasiapotilaista kokee ahdistusta ja/tai masennusta. Nämä tilat liittyvät kohonneeseen sairauden pahenemisen riskiin, ja masennus on erityisesti yhteydessä lyhyempään aikaan ensimmäiseen pahenemiseen. Siksi ahdistuksen ja masennuksen sisäisen roolin tutkiminen sairauden etenemisessä on ratkaisevan tärkeää.

Osallistujavalintakriteerien mukaisesti tähän tutkimukseen otetaan osallistujia, joille on diagnosoitu bronkiektasia Union-sairaalassa, Tongjin lääketieteellisessä korkeakoulussa, Huazhongin tieteen ja tekniikan yliopistossa, Guizhoun maakunnan kansansairaalassa ja Yichangin keskussairaalassa 20. joulukuuta 2025 ja 31. joulukuuta 2030 välisenä aikana. Tutkimussuunnitelma hyväksyttiin kunkin sairaalan tutkimuseettisillä lautakunnilla. Rekisteröitymisessä kerätään seuraavat demografiset tiedot: sukupuoli, ikä, pituus (metreinä) ja paino (kilogrammoina). Sairaushistoria, aiemmat pahenemiset ja verikokeiden tulokset (mukaan lukien täydellinen verenkuva ja biokemialliset parametrit) saadaan myös alustavan konsultaation aikana. Patogeenitutkimusten tulokset myös tallennetaan. Lisäksi suoritetaan keuhkotoimintatestit (esim. ennustettu FEV1%) ja korkearesoluutioiset tietokonetomografiat (HRCT) keuhkoista. Potilaiden hengenahdistusta arvioidaan muokatulla Medical Research Council (mMRC) -hengitysvaikeusasteikolla, kun taas ahdistus- ja masennustilaa arvioidaan sairaala-ahdistus- ja masennusasteikolla (HADS). Tietoisella suostumuksella kerättiin biologisia näytteitä, mukaan lukien verta, räkä ja uloste. Osallistujia seurattiin kolmen kuukauden välein rekisteröinnin jälkeen, ja pahenemisten tiheys, sairaalahoitojaksot ja selviytymistila pidettiin kirjattuna. Datan keräämisen päätyttyä suoritetaan metabolomiikka-analyysi näytteille, mukaan lukien veri, räkä ja uloste, tutkiakseen, ovatko potilaiden ahdistus- ja masennustilat yhteydessä edellä mainittuihin metabolomiikkatuloksiin, tunnistaakseen vastaavat biomarkkerit ja analysoidakseen ahdistuksen ja masennuksen roolia bronkiektasian etenemisessä.

Aineistot ja menetelmät

1. Datan kerääminen Osallistujavalinta- ja poissulkemiskriteerit

   Osallistujavalintakriteerit:

   • Ikä ≥18 vuotta
   • Osallistujien keuhkokuvantamislöydökset ja kliininen esitys täyttivät bronkiektasian diagnoosikriteerit
   • Kliinisesti vakaa (ei antibiootteja tai suun kautta otettavia kortikosteroideja 4 viikkoa ennen rekisteröintiä);
   • Potilaat, jotka ovat halukkaita allekirjoittamaan suostumuslomakkeen ja osallistumaan tutkimukseen.

   Poissulkemiskriteerit:

   • Ikä <18 vuotta
   • Ei täytä bronkiektasian diagnoosikriteerejä
   • Osallistujat, joilla on kystinen fibroosi tai aiempi keuhkosirutus
   • Osallistujat, jotka eivät pysty yhteistyöhön tutkimuksen kanssa elintärkeiden järjestelmien, kuten sydämen, aivojen, maksan ja munuaisten, toimintahäiriön vuoksi tai jotka eivät pysty osallistumaan tutkimukseen vakavien sairauksien vuoksi
   • Osallistujat, joilla on aktiivisia sairauksia, mukaan lukien aktiivinen tuberkuloosi, aktiivinen allerginen bronkopulmonaalinen aspergilloosi, aktiivinen ei-tuberkuloosinen mykobakteeri-infektio ja pahanlaatuinen kasvain tai toissijainen vetobronkiektasia, joka liittyy keuhkofibroosiin
   • Raskaana olevat tai imettävät naiset
   • Ne, jotka eivät pysty antamaan tietoista suostumusta tai jotka kieltäytyvät osallistumasta kliiniseen tutkimukseen

   Potilaiden demografisten indikaattorien ja laboratoriotestitulosten kerääminen. Demografiset indikaattorit (ikä, pituus, paino), mMRC-pisteet, laboratoriotestitulokset, keuhkotoiminta (ennustettu FEV1%), radiologiset pisteet (muokattu Reiff, Bhalla-pisteet) kerättiin osallistujan rekisteröityessä.

   Ahdistus- ja masennustilan arviointi: Kaikkia potilaita pyydettiin täyttämään sairaala-ahdistus- ja masennusasteikko (HADS) perustasolla. Jokaisen ala-asteikon (HADS-masennus ja -ahdistus) pisteet vaihtelevat 0–21 pisteen välillä, ja pisteet ≥8 osoittavat todennäköistä masennusta tai ahdistusta.

   Sairauden vaikeusasteen arviointi: Sairauden vaikeusastetta arvioitiin bronkiektasian vaikeusindeksillä (BSI).

2. Metabolomiikan kokeelliset menetelmät Metabolomiikan kokeelliset menetelmät 2.1 Näytteen valmistelu 50 µL kerättyä näytettä sulatettiin jäällä ja sekoitettiin 200 µL:aan kylmää metanolia:asetonitriilia (1:1, v/v), joka sisälsi sisäisen standardin (IS, 1 µg/mL). Sekoitusta ravisteltiin voimakkaasti, säilytettiin -20°C:ssa 2 tuntia ja sitten sentrifugoitiin 14 000 g:llä 15 minuuttia 4°C:ssa. Ylälaimenne siirrettiin uuteen pulloon LC-MS-analyysiä varten. Yhdistetty laadunvalvonta (QC) -näyte valmistettiin yhdistämällä yhtä suuret osat kaikista yksittäisistä näytteistä.

   2.2 LC-MS-analyysi Kromatografinen erotus suoritettiin Waters ACQUITY UPLC -järjestelmällä käyttäen HSS T3 -saraketta (2,1 × 100 mm, 1,8 µm), joka pidettiin 40°C:ssa. Liikkuva faasi koostui (A) vedestä, jossa on 0,1 % muurahaishappoa, ja (B) asetonitriilistä, jossa on 0,1 % muurahaishappoa. Lineaarinen gradientti sovellettiin seuraavasti: 0–2 min, 2 % B; 2–10 min, 2 %:sta 98 %:iin B; 10–12 min, 98 % B; 12–12,1 min, 98 %:sta 2 %:iin B; 12,1–15 min, 2 % B. Virtausnopeus oli 0,4 mL/min ja injektiotilavuus 2 µL.

   Massaspektrometria suoritettiin SCIEX TripleTOF 6600+ -järjestelmällä, joka toimi sekä positiivisessa että negatiivisessa ESI-tilassa. Parametrit asetettiin seuraavasti: Ionilähdekaasu 1: 60 psi, Ionilähdekaasu 2: 60 psi, Verhokaasu: 35 psi, Lähteen lämpötila: 550°C, Ionisuihkujännite: ±5500 V. Data kerättiin tiedonriippuvaisessa keruutilassa (IDA).

   2.3 Datan käsittely ja monimuuttujainen tilastollinen analyysi Raakadatatiedostot käsiteltiin MS-DIAL-ohjelmistolla huippujen poimimiseksi, kohdistamiseksi ja normalisoimiseksi sisäistä standardia vastaan. Tuloksena oleva datamatriisi tuotiin SIMCA-P-ohjelmistoon (v16.0, Umetrics, Ruotsi) monimuuttuja-analyysiä varten. Yksikkövarianssin skaalaus ja keskiarvon keskiarvoistaminen sovellettiin ennen PCA:ta ja OPLS-DA:ta. OPLS-DA-malli validoitiin 200-kertaisella permutaatiotestillä.

   Metaboliitit, joiden muuttujan tärkeys projektioissa (VIP) > 1,0 OPLS-DA-mallista ja p-arvo < 0,05 yksimuuttujaisesta Studentin t-testistä, pidettiin tilastollisesti merkitsevinä.

   2.4 Metaboliittien tunnistus Merkittävät metaboliitit tunnistettiin vertaamalla niiden tarkkaa massaa (massavirhe < 10 ppm) ja MS/MS-spektrejä HMDB-tietokannan merkintöihin. Mahdollisuuksien mukaan tunnistus vahvistettiin vertaamalla aitoon standardiin (luottamustaso 1).

3. Kliinisen datan tilastollinen analyysi ja menetelmät:

Tutkimuksen aikana saadut tiedot esikäsiteltiin. Jatkuville tiedoille suoritettiin ensin normaalijakaumatestit. Jos kaikki ryhmät täyttivät normaalijakauman, ryhmien väliseen vertailuun käytettiin Studentin t-testiä. Muussa tapauksessa harkittiin ei-parametrista Wilcoxonin järjestyssummatestiä. Luokitteluille käytettiin χ²-testiä. Tilastollisesti merkitsevät tiedot analysoitiin monimuuttujaisella logistisella regressioanalyysillä. P < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

Kaikkien tietojen tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS:llä (IBM SPSS Statistics 26.0, SPSS Inc., Chicago, IL) ja R-kielellä (versio 4.1.3, www.R-project.org/). Kaikki tilastolliset testit olivat kaksisuuntaisia, ja tilastollinen merkitsevyys asetettiin 0,05:een.