SGLT-2抑制剂在2型糖尿病中的羟基自由基相关作用

远端对称多发性神经病（DSPN）是2型糖尿病（T2D）最常见的微血管并发症之一，影响了大约50％的患者。 这种复杂性疾病涉及代谢和血管损伤，导致高血糖驱动的氧化应激，神经血流减少以及慢性亚临床炎症导致其发病机理的神经纤维损伤。

DSPN的存在会损害生活质量，并与死亡率增加有关。

尽管达到了最佳血糖控制，但由于多因素影响，包括慢性氧化应激和微血管损伤，糖尿病神经病经常进展。 传统疗法的重点是症状缓解，例如用抗惊厥药或抗抑郁药治疗疼痛，以及试图通过靶向高血糖来减缓疾病进展的尝试。 因此，解决其他致病因素（包括氧化应激）的新干预措施可以改善DSPN的临床结果。 在糖尿病神经病的病因中，氧化应激起着重要作用。

在生理条件下，苯丙氨酸在Para位置酶促化，产生para-酪氨酸。 然而，在氧化应激增加的条件下，例如在羟基自由基（•OH）攻击期间，苯丙氨酸在正骨和元位置可能会误羟基化，从而引起正苯胺（O-TYR）和meta-酪氨酸（M -tyr）。 这些非典型酪氨酸异构体在健康状态中通常可以忽略不计。因此，它们的升高水平或异常比率是羟基自由基介导的氧化损伤的敏感生物标志物，这可能与与持续的氧化应激有关的慢性疾病特别相关。 鉴于这些氧化应激途径，α-硫酸（ALA）已被探讨为一种主要针对自由基生产的抗氧化剂疗法。

ALA被用作现有血糖管理策略的平行或辅助方法，短期试验显示神经传导速度和神经性症状的显着改善。 同时，正如我们先前证明的那样，ALA治疗作为一种全身性抗氧化剂治疗，同时可能对心血管硬终点产生有益的作用。

尽管ALA治疗强调了解决氧化机制的重要性，但目前正在研究潜在的更广泛的保护作用，但目前正在研究钠 - 葡萄糖共转运蛋白-2（SGLT-2）抑制剂。

SGLT-2抑制剂通过阻断葡萄糖和钠的重吸收，在肾脏近端肾小管中发挥其主要作用，从而通过增强的尿葡萄糖排泄来导致胰岛素独立的血糖控制。 该过程诱导轻度的渗透利尿和纳地尿液，从而减少血液体积并导致血压临床相关的降低，通常在2-5 mmHg的范围内。 此外，已显示SGLT-2抑制剂可减轻氧化应激和炎症，即可能强调观察到的心血管和肾脏保护作用的机制。

动物实验已经证实，在糖尿病大鼠模型中，通过SGLT-2抑制作用改善了神经传导障碍并预防抑制eepi骨内神经纤维的损失，大概是通过降低血糖变异性，改善的微血管功能，并调节羟基自由基途径。

大型心血管试验（例如Empa-Reg，Canvas，声明）主要集中在心血管终点，而不是神经病特定的指标上。 在对EMPA-REG结果的事后分析中，估计仅血细胞比容的变化占Empagliflozin心血管益处的约52％。

尽管其他主要的SGLT-2抑制剂试验（声明-TIMI 58，帆布，Empa-kidney）没有提供相似百分比的分解，但他们每个人都报告了血细胞比容升高，这可能反映出可能产生的红细胞生成素样效果 - DAPA在DAPA中进一步强调了效果-CKD，升高的血细胞比容是该药物肾脏保护益处的关键因素。

另一方面，一项小的机械研究证明了使用canagliflozin仅在SGLT-2治疗的头4周中存在促红细胞生成素血清水平的暂时升高长治疗期。 Although there are other studies either suggesting longer duration of erythropoietin elevation even for 12 weeks by empagliflozin, or no increase of it at 24 weeks by dapagliflozin, both trials verified a retained increase in RBC-parameters for the whole treatment period by the SGLT-2抑制剂。

但是，到目前为止，很少有研究系统地评估了SGLT-2抑制剂的短期神经保护作用以及单个组中羟基自由基标记物和RBC参数的变化。

值得注意的是，康德尔（Kandeel）进行了全面的系统综述和荟萃分析，涉及六项人类研究和5,312名糖尿病患者，表明SGLT-2抑制剂中度改善了糖尿病外周神经病症状，包括改善。

为了支持这些发现，Ishibashi等人。报道说，适度控制的2型糖尿病患者的SGLT-2抑制剂治疗三年可显着改善神经病结局和减速性肾病的进展。 此外，最近的观点强调，早期干预和解决多种代谢因素可能会稳定甚至逆转DSPN的神经损害，而短期临床证据表明，伴糖酶可以改善电生理参数，减少氧化应激标志物，并减少2型神经性症状，并减少2型神经性症状。糖尿病患者。

这些发现指出了超出血糖控制的机制，包括RBC形成，羟基自由基代谢产物（例如正常和元酪氨酸）的变化以及肾血液动力学。

鉴于这些令人鼓舞的数据，我们测试了一项为期4周的干预措施，以捕获立即的RBC和羟基自由基变化以及早期的神经性变化。

鉴于现有治疗的功效有限，这些潜在的保护作用在糖尿病神经病的复杂性的背景下尤其显着，并且通过直接或间接减少氧化应激和影响神经损害的途径，SGLT-2抑制剂可能会导致范围内的范围抑制作用，这使得管理这一具有挑战性的并发症。

Against this background, our study focuses on evaluating the short-term effects of SGLT-2 inhibitor (dapagliflozin or empagliflozin) therapy on diabetic neuropathy-related measures, hydroxyl radical markers, abnormal albuminuria, and RBC-parameters in patients with type 2 diabetes mellitus 。 具体而言，我们旨在确定为期四周的SGLT-2抑制剂疗法是否可以在早期或轻度异常的T2D患者中产生可测量的神经性功能变化，并回顾羟基自由基标记物的变化与这些临床和实验室发现如何相关。

材料和方法

研究人群，包含/排除标准总共招募了40名成人T2D患者。 符合条件的参与者包括那些除了管理任何现有的抗糖尿病方案外，该治疗医师决定基于标准的临床适应症来启动SGLT-2抑制剂治疗（Empagliflozin或Dapagliflozin）。

该研究包括HBA1C <10％和EGFR> 30ml/min/1.73岁的T2D患者 M2。 在40例患者中，没有一个报告疼痛的神经病（DN4问卷），有9例表现出神经性感觉症状（NTSS问卷），而9例显示了保护性感觉的丧失（单丝测试）。 根据神经病障碍评分（NDS），14例患者患有轻度神经病，16例中度神经病，4例患有严重的神经病，表明大多数患者均患有无症状神经病。 如果患者患有非糖尿病病因（即遗传性，药物或毒素诱导的，未经治疗的甲状腺功能减退，叶酸缺乏症（低于3.9 µg/L），维生素B12缺乏症（低于200 ng/L），晚期200 ng/L），晚期，晚期，高于200 ng/l），将患者排除在外。肝肾脏疾病不符合纳入标准，自身免疫性疾病，恶性肿瘤，或者是否从事定期过度饮酒（男性超过两个单位，女性每天超过一个单位） - 一个单位定义为15 g纯酒精）。 还排除了严重的外周动脉疾病，脚溃疡病史或复发性生殖器感染的患者。

研究设计和目标这项前瞻性，开放标签的单臂临床研究旨在研究钠 - 葡萄糖共转移蛋白-2（SGLT-2）抑制剂对远端对称糖尿病性糖尿病性多神经病的短期影响2型糖尿病（T2D）患者的肾脏参数。 基本原理是基于推定的机制，即SGLT-2抑制剂除了降低葡萄糖效应外，可能会影响羟基自由基标记物的形成，从而改善微血管并发症。 这包括红细胞（RBC）参数，异常蛋白尿和早期糖尿病神经病的潜在益处。 主要的假设是短期SGLT-2抑制剂疗法将减轻特异性酪氨酸代谢物比例，并伴随着改进的神经性测量和与RBC相关的指数。

干预和研究方案所有参与者接受了基线（第0周）评估，然后在SGLT-2抑制剂治疗4周后进行后续评估。 SGLT-2抑制剂的剂量和选择由临床团队根据标准治疗适应症确定。 该研究没有要求其他干预措施。

数据收集和问卷参与者在基线时完成了生活方式和药物问卷，记录饮食，运动，吸烟和酒精习惯，随之而来的药物和合并症。 对神经性全症状评分（NTSS）和DN4问卷进行了评估，以评估主观的神经性抱怨。

使用基于CA-12的软件系统（MSB-MET Ltd. 进行了定量的感觉测试，以在中位和佩隆神经上以三个频率（2000 Hz，250 Hz和5 Hz）的三个频率（2000 Hz，250 Hz和5 Hz）测量当前的感知阈值（CPT），从Aδ）和无髓利（5Hz C）小纤维的功能。 CPT值低于正常范围，表明过度休息，高于正常范围的值表明缺点。

进行了其他临床检查，以进行远端对称多神经病（DSPN）：

1. 深肌腱反射测试，以及128 Hz校准的调谐叉（振动），用于大型纤维功能障碍，并且
2. 针刺（疼痛）和小纤维功能障碍的温度感知。 即使患有2型糖尿病（T2D）患者的最常见并发症，即使患有良好控制的血症，对脚溃疡DSPN的风险的10 g单丝（保护性感觉）是最常见的并发症之一。 DSPN可以在“库存 - 爱”分布中以长度依赖的方式影响小神经纤维或两者的组合。

在基线和第4周收集实验室测量血液和尿液样品。 除了常规采样以外，不需要额外的静脉穿刺。出于研究目的，获得了大约10毫升的血液。

常规参数在第0周测量HBA1C。在第0周和第4周测量血清果糖，空腹葡萄糖和血清胰岛素。在第0周和第4周评估血清肌酐和估计的肾小球滤过率（EGFR）。 ，AST，ALT，GGT，ALP，LDH，INR，血清总蛋白，白蛋白，总胆固醇，HDL，LDL，尿酸血清铁，转铁蛋白，转铁蛋白，转铁蛋白饱和度和铁蛋白在第0周进行在第0周和第4周都测量了钾，红细胞沉积率（ESR），C反应蛋白（CRP）以及尿白蛋白和肌酐。

羟基自由基标记以探索羟基自由基途径及其与神经病，RBC形成和肾脏参数的联系，在基线和第4周时测量标记。通过高性能液相色谱法（HPLC）来定量Tyr），元酪氨酸（M-tyr）和矫正酪氨酸（O-TYR）。 除了这些代谢产物的直接浓度外，还计算出以下比率，以表征SGLT-2抑制剂治疗下氧化环境的变化：p-tyr/phe，m-tyr/phe，o-tyr/phe，o-tyr/phe，（m- Tyr+O-tyr）/phe，m-tyr/p-tyr，o-tyr/p-tyr，（m-tyr+o-tyr）/p-tyr，m-tyr/krea，p-tyr/krea ，o-tyr/krea，以及任何相应的血清和尿值。 这种综合的羟基化产物和衍生比率旨在详细评估羟基自由基活性及其对糖尿病并发症的潜在影响。

其他计算胰岛素抵抗（HOMA-IR）的体内平衡模型评估以评估胰岛素敏感性。 在整个研究中，还评估了尿白蛋白/肌酐比率（ACR）的变化以及与当前感知阈值（CPT）参数的相关性。

使用标准化的临床检查方法计算神经病障碍评分（NDS）。 该评估评估了大脚趾的踝部反射，振动感觉，销钉感觉和温度感觉。 最高总分数为10，分类如下：

3-5分：轻度神经病6-8点：中度神经病9-10分：严重的神经病

高性能液相色谱（HPLC）分析在常规血液采样期间，将静脉血液从患者带入天然管。 通过离心提取血清，并储存在-80°C之前，直到进一步检查。 此后，将125 µL三氯乙酸（TCA）添加到500 µL血清中，然后将样品在冰上孵育30分钟。 之后，通过离心分离沉淀物，并使用0.2μm注射器过滤器（Millipore Inc.）过滤上清液。 上清液存储在-80°C，直到进行进一步的过程或立即通过HPLC分析。 使用Shimadzu类LC-10 ADVP HPLC设备（美国Shimadzu Manufacturing Inc.，美国）进行HPLC分析。 将20μl的滤液注入到Licrospher-C18二氧化硅柱（Merck）上。 不同的氨基酸和异构体：使用其自荧光检测到苯丙氨酸（PHE），py-酪氨酸（P-TYR），元酪氨酸（M-TYR），Ortho-酪氨酸（O-TYR）。 使用Shimadzu RF-10AXL荧光检测器在275 nm激发和305 nm的发射下测量P-，M-，O-TYR，而在258 nm激发和288 nm发射时进行了PHE。 进行了含有1％乙酸，1％乙酸钠和98％蒸馏水的洗脱液的等距流。 为了确定不同氨基酸和异构体的浓度，使用了外部标准。

统计分析数据通过生物统计学家使用适当的方法进行了配对的比较，以及相关性和回归分析，以识别神经病，羟基自由基相关和代谢参数变化的潜在预测因素。 亚组分析综述了基线异常CPT值的患者，以识别SGLT-2抑制剂疗法是否可以在患有神经性改变的患者中赋予更大的神经学益处。 使用Kolmogorov-Smirnov的正态性测试测试了参数的分布。 使用配对样品t检验比较了基线和第4周之间参数的变化。

相关分析是通过Pearson（正常分布）或Spearman的Rho（非正常分布）测试进行的。 建立了具有逐步方法的线性回归模型，以评估神经病，RBC参数和蛋白尿的预测因子。 社会科学统计软件包（SPSS）版本28（IBM，Armonk，纽约，美国）进行统计分析。 低于0.05的“ P”值被认为具有统计学意义。

总而言之，该方法旨在研究短期SGLT-2抑制剂治疗，通过减少自由基生成并改善RBC指数和异常蛋白尿，还可以在糖尿病神经病功能和相关的相关羟基自由基方面进行可测量的改善。