Effetti associati ai radicali liberi idrossilici degli inibitori SGLT-2 nel diabete di tipo 2

La poliniopatia simmetrica distale (DSPN) è una delle complicanze microvascolari più comuni del diabete mellito di tipo 2 (T2D), che colpisce circa il 50% dei pazienti nel corso della loro malattia. Questo disturbo complesso coinvolge insulti sia metabolici che vascolari che portano a danni alle fibre nervose con stress ossidativo guidato dall'iperglicemia, ridotto flusso sanguigno nervoso e infiammazione subclinica cronica che contribuisce alla sua patogenesi.

La presenza di DSPN compromette la qualità della vita ed è associata anche ad un aumento della mortalità.

Nonostante il raggiungimento del controllo glicemico ottimale, la neuropatia diabetica progredisce spesso a causa delle influenze multifattoriali, tra cui lo stress ossidativo cronico e le lesioni microvascolari. Le terapie tradizionali si sono concentrate sul sollievo sintomatico, come la gestione del dolore con anticonvulsiranti o antidepressivi e sui tentativi di rallentare la progressione della malattia prendendo di mira l'iperglicemia. Di conseguenza, nuovi interventi che affrontano ulteriori fattori patogeni, incluso lo stress ossidativo, potrebbero offrire risultati clinici migliorati nel DSPN. Nell'eziologia della neuropatia diabetica, lo stress ossidativo svolge un ruolo significativo.

In condizioni fisiologiche, la fenilalanina è idrossilata enzimaticamente in posizione para, producendo para-tirosina. Tuttavia, in condizioni di aumento dello stress ossidativo, ad esempio durante l'attacco radicale idrossile (• OH), la fenilalanina può essere insignificante nelle posizioni orto e meta -Tyr). Questi isomeri atipici di tirosina sono in genere trascurabili in stati sani; Pertanto, i loro livelli elevati o l'aumento dei rapporti anormali fungono da biomarcatori sensibili del danno ossidativo mediato dai radicali idrossilici, che possono essere particolarmente rilevanti nelle malattie croniche associate allo stress ossidativo persistente. Dati questi percorsi di stress ossidativo, l'acido alfa-lipoico (ALA) è stato esplorato come una terapia antiossidante che colpisce principalmente la produzione di radicali liberi.

L'ALA è stato utilizzato come approccio parallelo o aggiuntivo alle strategie di gestione glicemica esistenti, con studi a breve termine che mostrano miglioramenti significativi nella velocità di conduzione nervosa e nei sintomi neuropatici. Allo stesso tempo, la terapia ALA come trattamento antiossidante sistemico, allo stesso tempo, può avere un effetto benefico sugli endpoint rigorosi cardiovascolari, come abbiamo dimostrato in precedenza.

Mentre la terapia ALA sottolinea l'importanza di affrontare i meccanismi ossidativi, gli inibitori del cotransporter-2 di sodio-glucosio (SGLT-2) sono attualmente sotto inchiesta per effetti protettivi potenzialmente più ampi.

Gli inibitori di SGLT-2 esercitano il loro effetto primario nel tubulo prossimale del rene bloccando il riassorbimento di glucosio e sodio, con conseguente controllo glicemico indipendente dall'insulina attraverso un'escrezione di glucosio urinaria. Questo processo induce una lieve diuresi osmotica e natriuresi, riducendo così il volume del sangue e portando a una riduzione clinicamente rilevante della pressione sanguigna, in genere nell'intervallo di 2-5 mmHg. Inoltre, è stato dimostrato che gli inibitori di SGLT-2 mitigano lo stress e l'infiammazione ossidativa, cioè meccanismi che possono sottolineare gli effetti di protezione cardiovascolare e renale osservati.

Gli esperimenti sugli animali hanno confermato un miglioramento dei deficit di conduzione nervosa e la prevenzione della perdita di fibre nervose intraepidermiche con inibizione SGLT-2 nei modelli di ratto diabetico, presumibilmente attraverso una ridotta variabilità glicemica, una migliore funzione microvascolare e una modulazione delle vie radicali idrossiliche.

I grandi studi cardiovascolari (ad es. Empa-reg, tela, dichiarano) si sono concentrati principalmente sugli endpoint cardiovascolari piuttosto che su metriche specifiche della neuropatia. In un'analisi post hoc del risultato EMPA-Reg, si stima che i cambiamenti nella sola ematocrito rappresentassero circa il 52% del beneficio cardiovascolare di Empagliflozin.

Sebbene altri importanti studi di inibitore SGLT-2 (Dichiara-Timi 58, Canvas, Empa-Kidney) non abbiano fornito una scomposizione di percentuali simili, ciascuno ha riportato elevazioni di ematocrit che potrebbero riflettere un possibile effetto simile all'eritropoietina-un effetto ulteriormente evidenziato in DAPA -CKD, dove si pensava che un aumento dell'ematocrito fosse un fattore chiave nei benefici nefroprotettivi del farmaco.

D'altra parte, uno studio piccolo e meccanicistico ha dimostrato un elevazione temporanea del livello sierico di eritropoietina usando Canagliflozin, che era presente solo nelle prime 4 settimane di terapia SGLT-2, mentre l'aumento dell'ematocrito era prolungato per il tutto, 12 settimane Periodo di trattamento lungo. Sebbene ci siano altri studi che suggeriscono una durata più lunga dell'elevazione di eritropoietina anche per 12 settimane da parte di empagliflozin, o nessun aumento di esso a 24 settimane da parte di Dapagliflozin, entrambi gli studi hanno verificato un aumento trattenuto nei parametri di RBC per l'intero periodo di trattamento da parte della SGLT-2 inibitori.

Tuttavia, fino a questa data, pochi studi hanno sistematicamente valutato l'impatto neuroprotettivo a breve termine degli inibitori di SGLT-2 insieme alle variazioni dei marcatori radicali idrossilici e dei parametri RBC in una singola coorte.

In particolare, una revisione sistematica e una meta-analisi completa di Kandeel, che coinvolgono sei studi sull'uomo e un totale di 5.312 pazienti diabetici, hanno dimostrato che gli inibitori SGLT-2 hanno migliorato moderatamente i sintomi della neuropatia periferica diabetica, tra cui i migliori sintomi di conduttori sensoriali e motori .

A sostegno di questi risultati, Ishibashi et al. ha riferito che tre anni di terapia con inibitore SGLT-2 in pazienti con diabete di tipo 2 modestamente controllato hanno migliorato significativamente gli esiti della neuropatia e la progressione della nefropatia decelerata. Inoltre, le recenti prospettive sottolineano che l'intervento precoce e l'affrontare molteplici fattori metabolici possono stabilizzare o addirittura il danno ai nervi inverso nel DSPN e prove cliniche a breve termine mostrano che l'empagliflozina può migliorare i parametri elettrofisiologici, ridurre i marker di stress ossidativo e moderare sintomi neuropatici nel tipo 2 pazienti diabetici.

Questi risultati indicano i meccanismi che si estendono oltre il controllo glicemico, che comprendono la formazione di RBC, i cambiamenti nei metaboliti radicali idrossilici (come l'orto e la meta-tirosina) ed l'emodinamica renale.

Dati questi dati incoraggianti, abbiamo testato un intervento di 4 settimane per catturare cambiamenti radicali di RBC e idrossile immediati e cambiamenti neuropatici precoci.

Given the limited efficacy of existing treatments, these potential protective effects are particularly salient in the context of diabetic neuropathy's complexity and, by directly or indirectly reducing oxidative stress and influencing pathways that underlie nerve damage, SGLT-2 inhibitors could herald a paradigm shift in the Gestione di questa complicazione impegnativa.

In questo contesto, il nostro studio si concentra sulla valutazione degli effetti a breve termine dell'inibitore SGLT-2 (Dapagliflozin o Empagliflozin) su misure legate alla neuropatia diabetica, marcatori radicali idrossilici, albuminuria anormale e albuminuria anormale . In particolare, miriamo a determinare se una terapia di inibitore SGLT-2 di quattro settimane può produrre cambiamenti misurabili nella funzione neuropatica tra i pazienti T2D con anomalie precoci o lievi e a rivedere come i cambiamenti nei marcatori radicali idrossilici si collegano a questi risultati clinici e di laboratorio.

Materiali e metodi

Popolazione dello studio, criteri di inclusione/esclusione Un totale di 40 pazienti con T2D adulti sono stati arruolati allo studio. I partecipanti ammissibili includevano quelli per i quali, oltre a somministrare qualsiasi regime antidiabetico esistente, il medico curante ha deciso di avviare la terapia con inibitori SGLT-2 (empagliflozin o Dapagliflozin) basata su indicazioni cliniche standard.

Lo studio includeva pazienti T2D di età compresa tra 18 e 75 anni con HbA1C <10% ed EGFR> 30 ml/min/1,73 M2. Dei 40 pazienti, nessuno ha riportato una neuropatia dolorosa (questionario DN4), 9 hanno mostrato sintomi sensoriali neuropatici (questionario NTSS) e 9 hanno mostrato perdita di sensazione protettiva (test di monofilamento). Secondo il punteggio della disabilità della neuropatia (NDS), 14 pazienti avevano una neuropatia lieve, 16 avevano neuropatia moderata e 4 avevano una neuropatia grave, indicando che la maggior parte dei pazienti aveva una neuropatia asintomatica preesistente. I pazienti sono stati esclusi nel caso in cui avessero neuropatie di eziologia non diabetica (cioè, ipotiroidismo ereditario, indotto da tossina, non trattato, carenza di folati (inferiore a 3,9 µg/L), carenza di vitamina B12 (inferiore a 200 ng/l), avanzato La malattia epatica -renale non soddisfa i criteri di inclusione, la malattia autoimmune, la malignità o se sono state impegnate in un eccessivo consumo eccessivo di alcol (più di due unità negli uomini e più di un'unità al giorno nelle donne - un'unità è stata definita come 15 g di Alcool puro). Sono stati anche esclusi i pazienti con grave malattia arteriosa periferica, una storia di ulcerazione del piede o infezioni genitali ricorrenti.

Progettazione e obiettivi dello studio Questo studio clinico prospettico, aperto e singolo mirava a studiare gli effetti a breve termine degli inibitori del cotrasporter-2 del sodio-glucosio (SGLT-2) sulla poliniopatia diabetica simmetrica distale, ematologica idrossilica e ematologica correlata e parametri renali nei pazienti con diabete mellito di tipo 2 (T2D). La logica si basava sul meccanismo putativo in base al quale, al di là del loro effetto di abbassamento del glucosio, gli inibitori della SGLT-2 possono influenzare la formazione di marker radicali idrossilici e quindi migliorare le complicanze microvascolari. Ciò include potenziali benefici sui parametri di globuli rossi (RBC), albuminuria anormale e neuropatia diabetica in fase iniziale. L'ipotesi primaria era che la terapia con inibitore SGLT-2 a breve termine mitigava le vie dei radicali liberi idrossilici specificamente i rapporti di metaboliti tirosina accompagnati da misurazioni neuropatiche migliorate e indici correlati alla RBC.

Protocollo di intervento e studio Tutti i partecipanti sono stati sottoposti a una valutazione di base (settimana 0) seguita da una valutazione di follow-up dopo 4 settimane di terapia con inibitori SGLT-2. La dose e la scelta dell'inibitore SGLT-2 sono state determinate dal team clinico in base alle indicazioni di trattamento standard. Non sono stati previsti interventi aggiuntivi dallo studio.

Raccolta dei dati e questionari I partecipanti hanno completato questionari sullo stile di vita e sui farmaci al basale, documentando dieta, esercizio fisico, fumo e abitudini alcoliche, farmaci concomitanti e comorbilità. Il punteggio dei sintomi totale neuropatico (NTSS) e i questionari DN4 sono stati somministrati per valutare i reclami neuropatici soggettivi.

Valutazioni neuropatiche La valutazione della neuropatia è stata eseguita presso il Centro Neuropatia del 2 ° Dipartimento di Medicina e Nefrologia-Diabete, Centro medico dell'Università di PéCS, utilizzando il sistema basato su software CA-12 (MSB-Met Ltd., Balatonfüred, Hungedy). Sono stati condotti test sensoriali quantitativi per misurare le soglie di percezione di corrente (CPT) a tre frequenze (2000 Hz, 250 Hz e 5 Hz) su nervo mediano e peroneale, fornendo informazioni su grandi mielini (2000Hz Aβ), mielini di dimensioni medie (250Hz (250Hz AΔ) e funzionalità di fibre di piccole fibre (5Hz C) non mielinizzate. I valori di CPT al di sotto dell'intervallo normale indicano iperestesia e i valori al di sopra dell'intervallo normale indicano l'ipoestesia.

Ulteriori esami clinici sono stati condotti per la polneuropatia simmetrica distale (DSPN):

1. Test del riflesso del tendine profondo e forcella di sintonizzazione calibrata a 128 Hz (vibrazione) per disfunzione di fibre di grandi dimensioni e
2. Pinprick (dolore) e percezione della temperatura per disfunzione in fibra ridotta. La valutazione del monofilamento da 10 g (sensazione di protezione) per il rischio di sviluppare ulcere del piede DSPN è una delle complicanze più comuni nei pazienti con diabete di tipo 2 (T2D), anche con glicemia ben controllata. DSPN può influire sulle fibre nervose piccole o grandi o una combinazione di entrambi in modo dipendente dalla lunghezza, in una distribuzione "calza-baglio".

Misurazioni di laboratorio campioni di sangue e urina sono stati raccolti al basale e alla settimana 4. Non era richiesta alcuna venipuntura aggiuntiva oltre il campionamento di routine; Circa 10 ml di sangue sono stati ottenuti a fini di ricerca.

Parametri di routine L'HbA1c è stato misurato alla settimana 0. La fruttosamina sierica, il glucosio a digiuno e l'insulina sierica sono stati misurati sia alla settimana 0 che alla settimana 4. La creatinina sierica e il tasso di filtrazione glomerulare stimata (EGFR) , AST, ALT, GGT, ALP, LDH, INR, proteina totale sierica, albumina, colesterolo totale, HDL, LDL, ferro sierico di acido urico, transferrina, saturazione di transferrina e ferritina sono stati misurati alla settimana 0, mentre i trigliceridi, sodio sierico, Il tasso di sedimentazione di potassio, eritrociti (ESR), proteina C-reattiva (CRP) e albumina urinaria e creatinina sono stati misurati sia alla settimana 0 che alla settimana 4.

Marcatori radicali liberi idrossilici per esplorare la via dei radicali liberi idrossilici e il suo collegamento con la neuropatia, la formazione di globuli rossi e i parametri renali, i marcatori sono stati misurati al basale e alla settimana 4. Fenilalanina sierica e urinaria (PHE), para-tirosina (P- Tyr), meta-tirosina (M-tyr) e orto-tirosina (O-tyr), sono stati quantificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Oltre alle concentrazioni dirette di questi metaboliti, sono stati calcolati i seguenti rapporti per caratterizzare i cambiamenti nell'ambiente ossidativo nell'ambito della terapia con inibitore SGLT-2: p-tyr/phe, m-tyr/phe, o-tyr/phe, (m- (m- Tyr+o-tyr)/phe, m-tyr/p-tyr, o-tyr/p-tyr, (m-tyr+o-tyr)/p-tyr, m-tyr/krea, p-tyr/krea , O-Tyr/Krea, nonché eventuali valori sierici e urinari corrispondenti. Questo pannello completo di prodotti di idrossilazione e rapporti derivati ​​mirava a fornire una valutazione dettagliata dell'attività dei radicali liberi idrossilici e la sua potenziale influenza sulle complicanze diabetiche.

Ulteriori calcoli La valutazione del modello di omeostasi dell'insulino-resistenza (HOMA-IR) è stata calcolata per valutare la sensibilità all'insulina. Sono stati valutati anche i cambiamenti nel rapporto albumina urinaria/creatinina (ACR) e le correlazioni con i parametri di soglia di percezione attuale (CPT).

Il punteggio di disabilità della neuropatia (NDS) è stato calcolato utilizzando un approccio di esame clinico standardizzato. Questa valutazione valuta i riflessi della caviglia, la sensazione di vibrazione, la sensazione di pin-prosciutto e la sensazione di temperatura all'alluce. Il punteggio totale massimo è 10, classificato come segue:

3-5 punti: neuropatia lieve 6-8 punti: neuropatia moderata 9-10 punti: neuropatia grave

La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) analizza il sangue venoso è stato preso da pazienti in tubi nativi durante il campionamento del sangue di routine. Il siero è stato estratto mediante centrifugazione ed è stato conservato a -80 ° C in attesa di un ulteriore esame. Successivamente, 125 µl di acido triclolo-acetico (TCA) sono stati aggiunti a 500 µl di siero, quindi i campioni sono stati incubati su ghiaccio per 30 minuti. Successivamente, il precipitato è stato separato dalla centrifugazione e il surnatante è stato filtrato utilizzando un filtro a siringa da 0,2 μm (Millipore Inc.). Il surnatante è stato conservato a -80 ° C fino a quando non è stato sottoposto a ulteriori processi o è stato immediatamente analizzato da HPLC. L'analisi HPLC è stata effettuata utilizzando un dispositivo HPLC ADPC di classe LC-10 Shimadzu (Shimadzu Manufacturing Inc., USA). Un 20 μL di filtrato è stato iniettato su una colonna di silice Licrospher-C18 (MERCK). Diversi aminoacidi e isomeri: fenilalanina (PHE), para-tirosina (p-tyr), meta-tirosina (M-tyr), orto-tirosina (O-tyr) sono stati rilevati usando la loro autofluorescenza. P-, M-, O-TYR sono stati misurati a 275 nm di eccitazione e emissione di 305 nm, mentre il PHE è stato valutato con eccitazione di 258 nm e emissione di 288 nm utilizzando un rivelatore fluorescente Shimadzu RF-10AXL. Sono stati eseguiti un flusso isocratico dell'eluente contenente acido acetico all'1%, acetato di sodio all'1% e acqua distillata al 98%. Per la determinazione delle concentrazioni di diversi aminoacidi e isomeri, sono stati utilizzati standard esterni.

I dati di analisi statistica sono stati analizzati da un biostatistico utilizzando metodi appropriati per confronti accoppiati, nonché analisi di correlazione e regressione per identificare i potenziali predittori di cambiamento nei parametri neuropatia, correlati ai radicali idrossilici e metabolici. Le analisi dei sottogruppi hanno esaminato i pazienti con valori CPT basali anormali per discernere se la terapia con inibitore SGLT-2 potrebbe conferire maggiori benefici neurologici in quelli con alterazioni neuropatiche preesistenti. La distribuzione dei parametri è stata testata utilizzando il test di normalità di Kolmogorov-Smirnov. Le variazioni dei parametri tra basale e settimana 4 sono state confrontate utilizzando il test t di campione accoppiato.

Le analisi correlazionali sono state eseguite dai test di Rho (distribuzione non normali) di Pearson (distribuzione normale) o di Spearman. Sono stati stabiliti modelli di regressione lineare con metodo graduale per valutare i predittori di neuropatia, parametri RBC e albuminuria. Il pacchetto statistico per le scienze sociali (SPSS) versione 28 (IBM, Armonk, New York, Stati Uniti) è stato utilizzato per analisi statistiche. Un valore "P" inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

In sintesi, i metodi sono stati progettati per studiare se la terapia con inibitori SGLT-2 a breve termine, riducendo la generazione di radicali liberi idrossilici e migliorando gli indici di globuli rossi e l'albuminuria anormale, potrebbe anche produrre miglioramenti misurabili nella funzione neuropatica diabetica e radicali liberi idrossilici correlati.