Efeitos associados ao radical livre hidroxila dos inibidores de SGLT-2 no diabetes tipo 2

A polineuropatia simétrica distal (DSPN) é uma das complicações microvasculares mais comuns do diabetes mellitus tipo 2 (T2D), afetando aproximadamente 50% dos pacientes ao longo de sua doença. Esse distúrbio complexo envolve insultos metabólicos e vasculares, levando a danos nas fibras nervosas com estresse oxidativo acionado por hiperglicemia, fluxo sanguíneo nervoso reduzido e inflamação subclínica crônica que contribui para sua patogênese.

A presença de DSPN prejudica a qualidade de vida e também está associada ao aumento da mortalidade.

Apesar de alcançar o controle glicêmico ideal, a neuropatia diabética progride freqüentemente devido a influências multifatoriais, incluindo estresse oxidativo crônico e lesão microvascular. As terapias tradicionais se concentraram no alívio sintomático, como o manejo da dor com anticonvulsivantes ou antidepressivos e as tentativas de retardar a progressão da doença, visando a hiperglicemia. Consequentemente, novas intervenções que abordam fatores patogênicos adicionais, incluindo estresse oxidativo, podem oferecer melhores resultados clínicos no DSPN. Na etiologia da neuropatia diabética, o estresse oxidativo desempenha um papel significativo.

Sob condições fisiológicas, a fenilalanina é hidroxilada enzimaticamente na posição do para, produzindo para-tharosina. No entanto, sob condições de aumento do estresse oxidativo, por exemplo, durante o ataque do radical hidroxil (• OH), a fenilalanina pode ser mal-hidroxilada nas posições Ortho e Meta, dando origem à orto-totosina (O-Tyr) e meta-tiária (mi -Tyr). Esses isômeros atípicos da tirosina são tipicamente insignificantes em estados saudáveis; Assim, seus níveis elevados ou proporções anormais aumentadas servem como biomarcadores sensíveis de dano oxidativo mediado por radicais hidroxil, o que pode ser particularmente relevante em doenças crônicas associadas ao estresse oxidativo persistente. Dadas essas vias de estresse oxidativo, o ácido alfa-lipóico (ALA) foi explorado como uma terapia antioxidante que tem como alvo principalmente a produção de radicais livres.

O ALA foi utilizado como uma abordagem paralela ou adjuvante das estratégias de gerenciamento glicêmico existentes, com ensaios de curto prazo mostrando melhorias significativas na velocidade de condução nervosa e sintomas neuropáticos. Ao mesmo tempo, a terapia com ALA como tratamento sistêmico antioxidante, ao mesmo tempo pode ter um efeito benéfico nos pontos de extremidade rígidos cardiovasculares, como provamos anteriormente.

Enquanto a terapia com ALA ressalta a importância de combater os mecanismos oxidativos, os inibidores de cotransportadores de sódio-glicose-2 (SGLT-2) estão atualmente sob investigação por efeitos protetores potencialmente mais amplos.

Os inibidores de SGLT-2 exercem seu efeito primário no túbulo proximal do rim, bloqueando a reabsorção de glicose e sódio, resultando em controle glicêmico independente da insulina através da excreção aprimorada de glicose urinária. Esse processo induz uma diurese osmótica leve e natriurese, reduzindo assim o volume sanguíneo e levando a diminuições clinicamente relevantes na pressão arterial, normalmente na faixa de 2-5 mmHg. Além disso, os inibidores de SGLT-2 demonstraram mitigar o estresse e a inflamação oxidativos, isto é, mecanismos que podem sublinhar os efeitos de proteção cardiovascular e renal observados.

Experimentos em animais confirmaram aprimorados déficits de condução nervosa e prevenção de perda de fibra nervosa intraepidérmica com inibição de SGLT-2 em modelos de ratos diabéticos, presumivelmente através da variabilidade glicêmica reduzida, melhoria a função microvascular e a modulação das vias de radicais hidroxil.

Grandes ensaios cardiovasculares (por exemplo, EMPA-REG, tela, declaram) se concentraram principalmente em pontos de extremidade cardiovascular, em vez de métricas específicas de neuropatia. Em uma análise post hoc do resultado da EMPA-REG, estimou-se que as mudanças no hematócrito representam aproximadamente 52% do benefício cardiovascular da empagliflozina.

Embora outros ensaios principais de inibidores do SGLT-2 (declarar-timi 58, tela, empina-kidney) não forneceram uma quebra de porcentagem semelhante, cada um relatou elevações de hematócrito que podem refletir um possível efeito de eritropoietina-um efeito destacado ainda mais destacado no DAPA -CKD, onde o aumento do hematócrito foi considerado um fator -chave nos benefícios nefroprotetores do medicamento.

Por outro lado, um pequeno estudo mecanicista provou ser uma elevação temporária do nível sérico da eritropoietina usando canagliflozina, que estava presente nas primeiras 4 semanas de terapia SGLT-2 apenas, enquanto o aumento do hematócrito foi prolongado para o todo, 12 semanas Período de tratamento longo. Embora existam outros estudos sugerindo maior duração da elevação da eritropoietina mesmo por 12 semanas pela empagliflozina, ou nenhum aumento dela às 24 semanas por dapagliflozina, ambos os ensaios verificaram um aumento retido nos parâmetros de RBC para todo o período de tratamento pelo SGLT-2 inibidores.

No entanto, até esta data, poucos estudos avaliaram sistematicamente o impacto neuroprotetor de curto prazo dos inibidores de SGLT-2, juntamente com alterações nos marcadores de radicais hidroxila e nos parâmetros RBC em uma única coorte.

Notavelmente, uma revisão sistemática abrangente e metanálise por Kandeel, envolvendo seis estudos em humanos e um total de 5.312 pacientes diabéticos, demonstrou que o SGLT-2 inibe moderadamente a melhoria da neuropatia periférica diabética, incluindo as velocidades da condução sensorial e do nervo motor melhoradas e a estabilização autônoma potencial autonomia .

Em apoio a esses achados, Ishibashi et al. relataram que três anos de terapia inibidora de SGLT-2 em pacientes com diabetes tipo 2 controlados pelo tipo 2 melhoraram significativamente os resultados da neuropatia e desaceleraram a progressão da nefropatia. Além disso, perspectivas recentes enfatizam que a intervenção precoce e o tratamento de múltiplos fatores metabólicos podem estabilizar ou até reverter os danos no nervo no DSPN, e evidências clínicas de curto prazo mostram que a empagliflozina pode melhorar os parâmetros eletrofisiológicos, reduzir os marcadores de estresse oxidativo e sintomas neuropáticos moderados no tipo 2 pacientes diabéticos.

Esses achados apontam para os mecanismos que se estendem além do controle glicêmico, abrangendo a formação de RBC, alterações nos metabólitos do radical hidroxil (como orto e meta-tiprosina) e hemodinâmica renal.

Dados esses dados encorajadores, testamos uma intervenção de 4 semanas para capturar alterações imediatas de RBC e radical hidroxila, bem como mudanças neuropáticas precoces.

Dada a eficácia limitada dos tratamentos existentes, esses efeitos protetores potenciais são particularmente salientes no contexto da complexidade da neuropatia diabética e, direta ou indiretamente, reduzindo o estresse oxidativo e influenciando as vias que estão subjacentes ao dano do nervo, os inibidores do SGLT-2 poder Gerenciamento dessa complicação desafiadora.

Nesse contexto, nosso estudo se concentra na avaliação dos efeitos de curto prazo do inibidor da SGLT-2 (terapia com dapagliflozina ou empagliflozina) em medidas diabéticas relacionadas à neuropatia, marcadores hidroxila-radicais, albuminúria anormal e RBC-parâmetros em pacientes com 2 diabetes com 2 não . Especificamente, pretendemos determinar se uma terapia inibidora de SGLT-2 de quatro semanas pode produzir alterações mensuráveis ​​na função neuropática entre pacientes com DM2 com anormalidades precoces ou leves e revisar como as mudanças nos marcadores de radicais hidroxil se relacionam com esses achados clínicos e laboratoriais.

Materiais e métodos

População do estudo, critérios de inclusão/exclusão Um total de 40 pacientes com T2D adultos foram incluídos no estudo. Os participantes elegíveis incluíram aqueles para os quais, além de administrar qualquer regime antidiabético existente, o médico tratador decidiu iniciar a terapia inibidora de SGLT-2 (empagliflozina ou dapagliflozina) com base em indicações clínicas padrão.

O estudo incluiu pacientes com DM2 com idades entre 18 e 75 anos com HbA1c <10% e EGFR> 30ml/min/1.73 M2. Dos 40 pacientes, nenhum relatou neuropatia dolorosa (questionário DN4), 9 exibiram sintomas sensoriais neuropáticos (questionário do NTSS) e 9 mostraram perda de sensação protetora (teste de monofilamento). De acordo com o escore de incapacidade da neuropatia (NDS), 14 pacientes apresentaram neuropatia leve, 16 apresentaram neuropatia moderada e 4 apresentaram neuropatia grave, indicando que a maioria dos pacientes apresentava neuropatia assintomática preexistente. Os pacientes foram excluídos no caso de terem neuropatias de etiologia não diabética (isto é, hipotireoidismo hereditário, induzido por toxinas, induzido por toxina, deficiência de folato (abaixo de 3,9 µg/L), deficiência de vitamina B12 (abaixo de 200 ng/L), avançada, avançado, avançado, avançado, avançado, avançado, avançado, adiantado, avançado, avançado, avançado, a deficiência de vitamina B12 (abaixo de 200 ng/L), avançada, avançada, avançada, avançada, avançada, avançada, a deficiência de vitamina B12 (abaixo de 200 ng/l), avançada, avançada, avançada, avançada, avançada, avançada (abaixo de 3,9 µg/l), deficiência de vitamina B12 (abaixo de 200 ng/L) Doença hepática -renal não atende aos critérios de inclusão, doença auto -imune, malignidade ou se eles estavam envolvidos em consumo excessivo de álcool regular (mais de duas unidades em homens e mais de uma unidade por dia em mulheres - uma unidade sendo definida como 15 g de álcool puro). Pacientes com doença arterial periférica grave, histórico de ulceração dos pés ou infecções genitais recorrentes também foram excluídas.

Study design and objectives This prospective, open-label, single-arm clinical study aimed to investigate the short-term effects of sodium-glucose cotransporter-2 (SGLT-2) inhibitors on distal symmetric diabetic polyneuropathy, hydroxyl radical markers, and related hematological e parâmetros renais em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (T2D). A lógica foi baseada no mecanismo putativo pelo qual, além do seu efeito de redução de glicose, os inibidores do SGLT-2 podem influenciar a formação de marcadores radicais hidroxila e, assim, melhorar as complicações microvasculares. Isso inclui benefícios potenciais nos parâmetros de glóbulos vermelhos (RBC), albuminúria anormal e neuropatia diabética em estágio inicial. A hipótese primária foi que a terapia inibidora de SGLT-2 de curto prazo mitigaria as vias de radical livre hidroxila especificamente as taxas de metabolito tirosina acompanhadas por medições neuropáticas aprimoradas e índices relacionados ao RBC.

Protocolo de intervenção e estudo Todos os participantes foram submetidos a uma avaliação de linha de base (semana 0) seguida de uma avaliação de acompanhamento após 4 semanas de terapia inibidora de SGLT-2. A dose e a escolha do inibidor do SGLT-2 foram determinadas pela equipe clínica com base nas indicações padrão do tratamento. Nenhuma intervenção adicional foi exigida pelo estudo.

Os participantes da coleta e dos questionários completaram questionários de estilo de vida e medicamentos na linha de base, documentando dieta, exercício, tabagismo e hábitos de álcool, medicamentos concomitantes e comorbidades. Os questionários dos sintomas totais neuropáticos (NTSs) e DN4 foram administrados para avaliar queixas neuropáticas subjetivas.

Avaliações neuropáticas A avaliação de neuropatia foi realizada no Centro de Neuropatia do 2º Departamento de Medicina e Nefrologia-Diabetes Center, Faculdade de Medicina da Universidade de Pécs, usando o sistema baseado em software CA-12 (MSB-Met Ltd., Balatonfüred, Hungria). O teste sensorial quantitativo foi realizado para medir os limiares de percepção atuais (CPT) em três frequências (2000 Hz, 250 Hz e 5 Hz) no nervo mediano e peroneal, fornecendo informações sobre mielinizações mielinizadas (2000Hz Aβ) de tamanho médio (250Hz de 2000Hz (2000Hz) (250Hz AΔ) e não mielinizada (5Hz C) FIXAS DE PEQUENAS. Os valores de CPT abaixo da faixa normal indicam hiperestesia, e os valores acima da faixa normal indicam hipoestesia.

Exames clínicos adicionais foram realizados para polineuropatia simétrica distal (DSPN):

1. Teste de reflexo tendão profundo e bifão de ajuste calibrado de 128 Hz (vibração) para disfunção de fibras grandes e
2. Pinprick (dor) e percepção de temperatura para disfunção de fibra pequena. A avaliação de 10 g de monofilamento (sensação de proteção) para o risco de desenvolver úlceras nos pés DSPN é uma das complicações mais comuns em pacientes com diabetes tipo 2 (T2D), mesmo com glicemia bem controlada. O DSPN pode afetar as fibras nervosas pequenas ou grandes ou uma combinação de ambos de maneira dependente do comprimento, na distribuição de "luvas de meia".

Medições de laboratório Amostras de sangue e urina foram coletadas na linha de base e na semana 4. Não foi necessária uma função venosa adicional além da amostragem de rotina; Aproximadamente 10 ml de sangue foram obtidos para fins de pesquisa.

Parâmetros de rotina O HbA1c foi medido na semana 0. Fructosamina sérica, glicose em jejum e insulina sérica foram medidas na semana 0 e 4. , AST, ALT, GGT, ALP, LDH, INR, proteína total sérica, albumina, colesterol total, HDL, LDL, ferro sérico de ácido úrico, transferrina, saturação de transferrina e ferritina foram medidos na semana 0, enquanto os triglicerídeos, o sódio soro, o sódio, O potássio, a taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR), a proteína C-reativa (PCR) e albumina urinária e creatinina foram medidas na semana 0 e na semana 4.

Marcadores de radical livre hidroxila para explorar a via do radical livre hidroxila e sua ligação à neuropatia, formação de RBC e parâmetros renais, os marcadores foram medidos na linha de base e na semana 4. Serum e fenilalanina urinária (PHE), para-ticrosina (p- Tyr), meta-totrosina (m-Tyr) e orto-totosina (O-Tyr), foram quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Além das concentrações diretas desses metabólitos, foram calculadas as seguintes proporções para caracterizar alterações no meio oxidativo sob terapia inibidora de SGLT-2: p-Tyr/Phe, M-Tyr/Phe, O-Tyr/Phe, (M- Tyr+o-tyr)/phe, m-tyr/p-tyr, o-tyr/p-tyr, (m-tyr+o-tyr)/p-tyr, m-tyr/krea, p-tyr/krea , O-Tyr/Krea, bem como quaisquer valores de soro e urinário correspondentes. Este painel abrangente de produtos de hidroxilação e proporções derivadas destinadas a fornecer uma avaliação detalhada da atividade do radical livre de hidroxila e sua potencial influência nas complicações diabéticas.

Cálculos adicionais A avaliação do modelo de homeostase da resistência à insulina (HOMA-IR) foi calculada para avaliar a sensibilidade à insulina. Alterações na relação albumina/creatinina urinária (ACR) e correlações com os parâmetros de limiar de percepção atual (CPT) também foram avaliadas ao longo do estudo.

O escore de incapacidade da neuropatia (NDS) foi calculado usando uma abordagem padronizada de exame clínico. Esta avaliação avalia os reflexos do tornozelo, sensação de vibração, sensação de pin-pick e sensação de temperatura no dedão do pé. A pontuação total máxima é 10, categorizada da seguinte forma:

3-5 pontos: neuropatia leve 6-8 pontos: neuropatia moderada 9-10 pontos: neuropatia grave

A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) analisa o sangue venoso foi retirado de pacientes em tubos nativos durante a amostragem de sangue de rotina. O soro foi extraído por centrifugação e armazenado a -80 ° C, aguardando um exame mais aprofundado. Posteriormente, 125 µl de ácido tricloro-acético (TCA) foram adicionados a 500 µl de soro, depois as amostras foram incubadas no gelo por 30 minutos. Posteriormente, o precipitado foi separado por centrifugação e o sobrenadante foi filtrado usando um filtro de seringa de 0,2 μm (Millipore Inc.). O sobrenadante foi armazenado a -80 ° C até o processo posterior ou foi imediatamente analisado pelo HPLC. A análise de HPLC foi realizada usando um dispositivo HPLC da SHIMADZU CLASS LC-10 ADVP (Shimadzu Manufacturing Inc., EUA). 20 μl de filtrado foi injetado em uma coluna de sílica do Licrospher-C18 (Merck). Diferentes aminoácidos e isômeros: fenilalanina (PHE), para-tyrosina (p-Tyr), meta-tyrosina (M-Tyr), orto-totrosina (O-Tyr) foram detectados usando sua autofluorescência. P-, M-, O-Tyr foram medidos com excitação de 275 nm e emissão de 305 nm, enquanto o PHE foi avaliado com excitação de 258 nm e emissão de 288 nm usando um detector fluorescente Shimadzu RF-10AXL. Foi realizado um fluxo isocrático do eluente que contém 1% de ácido acético, acetato de sódio a 1% e 98% de água destilada. Para determinação das concentrações de diferentes aminoácidos e isômeros, foram utilizados padrões externos.

Os dados de análise estatística foram analisados ​​por um bioestatístico usando métodos apropriados para comparações emparelhadas, bem como análises de correlação e regressão para identificar potenciais preditores de mudança na neuropatia, parâmetros relacionados a radicais hidroxil e parâmetros metabólicos. As análises de subgrupos revisaram pacientes com valores de CPT de linha de base anormais para discernir se a terapia inibidora de SGLT-2 pode conferir maiores benefícios neurológicos naqueles com alterações neuropáticas pré-existentes. A distribuição dos parâmetros foi testada usando o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov. Alterações dos parâmetros entre a linha de base e a semana 4 foram comparadas usando o teste t de amostra emparelhado.

As análises correlacionais foram realizadas pelos testes de Pearson (Distribuição Normal) ou Rho (distribuição não normal) de Spearman. Modelos de regressão linear com método gradual foram estabelecidos para avaliar preditores de neuropatia, parâmetros de RBC e albuminúria. O pacote estatístico de ciências sociais (SPSS) versão 28 (IBM, Armonk, Nova York, Estados Unidos) foi usado para análises estatísticas. Um valor 'P' abaixo de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Em resumo, os métodos foram projetados para investigar se a terapia inibidora de SGLT-2 de curto prazo, reduzindo a geração de radicais livres de hidroxil e melhorando os índices de RBC e a albuminúria anormal, também poderia produzir melhorias mensuráveis ​​na função neuropática diabética e nos radicais livres hidroxil relacionados.