Akutní reakce na astma a polymorfismy adrenergních receptorů B2

Nejnovější dostupné statistiky ukazují, že přibližně 22,2 milionů lidí ve Spojených státech má astma. Z toho asi 55 % zažilo alespoň jeden útok v roce před průzkumem, což vedlo k 1,9 milionu návštěv na pohotovostních odděleních a 497 000 hospitalizací. Přirozenou anamnézou akutního astmatu je vymizení a 70 až 80 % lidí rychle odstraní obstrukci dýchacích cest po léčbě 7,5 až 10,0 mg nebulizovaného albuterolu. Existuje však podskupina pacientů s recidivujícími těžkými epizodami, kteří na tuto léčbu špatně reagují a vyžadují hospitalizaci k vyřešení. Přestože tito pacienti představují menšinu astmatiků, mají perzistující onemocnění, které tvoří převážnou většinu výdajů na urgentní péči. Přesto se o nich prakticky nic neví. V této přihlášce chceme testovat hypotézu, že tito jedinci špatně snášejí albuterol kvůli genetickým polymorfismům jejich beta 2 adrenergních receptorů (P2AR), které buď ovlivňují závažnost a/nebo snižují citlivost na krátkodobě působící bronchodilatátory.

Jednou z možností velkého klinického významu je, že pacienti, kteří nereagují na albuterol, mají geneticky podmíněné rozdíly v β2AR, které snižují účinnost. U tohoto receptoru byly popsány různé polymorfismy, přičemž největší pozornost je věnována substitucím jednonukleotidových polymorfismů (SNP) na aminokyselinových pozicích 16 (arginin za glycin, Arg16Gly) a 27 (glutamin za kyselinu glutamovou, Gln27Glu). Receptor Gly 16 vykazuje zvýšenou down-regulaci in vitro po expozici agonistovi, zatímco alela Arg 16 je odolnější. Alela Gly 16 je silně spojena s destabilizací astmatu, která se projevuje nočními symptomy a zvýšeným rizikem závažnosti. Naproti tomu homozygotnost Arg/Arg na pozici 16 byla spojena s horšími výsledky v prospektivních studiích pravidelného užívání krátkodobě působících β2 agonistů. Tento jev nebyl pozorován u astmatiků, kteří užívali albuterol podle potřeby, nebo u těch, kteří byli homozygotní pro glycin. Vzhledem k tomu, že více než 90 % subjektů v našich studiích a dalších subjektů s akutním astmatem užívá tento lék rutinně a velká většina je jím léčena urgentně, přítomnost alely Arg/Arg by mohla vést k horším odpovědím. Bylo také navrženo, že tento polymorfismus může také vyvolat podobné účinky s dlouhodobě působícími p2 agonisty. Vzhledem k tomu, že velké procento pacientů s astmatem chronicky užívá dlouhodobě působící sympatomimetika, může mít tento faktor opět přispívající účinek. Alternativně může být farmakogenetika β2AR zcela nedůležitá. Dvě studie naznačily, že ani jednotlivé genotypy v kodonu 16, ani haplotypy v β2AR nemají žádný účinek na akutní bronchodilatační odpověď na albuterol nebo salbutamol. Protože však tyto studie byly provedeny u stabilních pacientů, nemusí být reprezentativní pro nereagující skupinu popsanou výše.

V této studii navrhujeme navázat na předchozí metody, které jsme používali v péči o akutní astma. Klinická hodnocení a léčebné režimy jsou standardizovány pomocí cesty péče jako v předchozích studiích. Demografie, výška, váha, rasa, symptomy, příznaky, anamnéza v minulosti a rutinní užívání léků za předchozí měsíc před návštěvou indexu jsou zaznamenány na vstupním listu. Běžně získáváme informace o délce onemocnění, četnosti ataků, hospitalizacích, přijetích na JIP, intubacích a seznam obecných a specifických spouštěčů akutních exacerbací. Zaznamenáváme také léky na astma včetně perorálních a inhalačních steroidů, krátkodobě a dlouhodobě působících beta-adrenergních agonistů, antileukotrienů, anticholinergik a methylxanthinů. Do naší historie zahrnujeme všechny souběžně podávané léky včetně očních kapek (beta-blokátory a prostaglandiny), léků na srdce a antihypertenziva (beta-adrenergní aktivní látky a ACE inhibitory. Ptáme se lidí, jak berou své léky na astma, ale nemáme způsob, jak zjistit, zda je skutečně užívají tak, jak je předepsáno. Pokud jsou jejich léky získány v naší nemocnici, může být možné určit, kolik receptů je vyplněno, ale stále neznáme použití. Zaznamenáváme také užívání nelegálních drog, jako je kokain, heroin, OxyContin atd. Index tělesné hmotnosti (BMI) se vypočítá jako hmotnost v kg dělená výškou v metrech na druhou. Obezita je klasifikována jako BMI ≥ 30 kg/m2. Arteriální saturace kyslíkem se zjišťuje pulzní oxymetrií na vzduchu v místnosti a při hodnotách nižších než 90 % se podává doplňkový kyslík podle potřeby. Před léčbou je nejlepší ze tří maximálních výdechových průtoků (PEFR) považován za reprezentující počáteční stav omezení průtoku pacienta. Údaje PEFR jsou zaznamenávány v absolutních hodnotách i jako procento předpokládané normální hodnoty. Stejně jako v předchozích studiích, pokud pacientova obstrukce dýchacích cest bránila pacientovi v dosažení minimální hladiny na měřiči maximálního průtoku, je arbitrárně přiřazena hodnota 10, aby se zabránilo dělení nulou při výpočtu procentuálního zlepšení po albuterolu.

Subjekty dostávají buď 2,5 mg nebulizovaného albuterolu každých 20 minut ve třech dávkách nebo dvě dávky 5,0 mg albuterolu s odstupem 20 minut. Necitlivost na albuterol je definována jako selhání PEFR u akutně nemocného astmatika, které překročí 40 % předpokládané hodnoty po ≥7,5 mg albuterolu (2,5 mg aerosoly albuterolu q.20 min x3). Po dokončení každého schématu se PEFR opakuje a pacienti jsou znovu vyšetřeni. Rozhodnutí o přijetí a propuštění se přijímají podle předem stanovených kritérií. Pacienti jsou považováni za připravené k odeslání domů, pokud jsou asymptomatičtí, bez použití pomocných svalů, mají chybějící nebo snížené pískoty a dosáhli maximálního průtoku 60 % předpokládané hodnoty. Těm, kteří tyto požadavky nesplňují, je na základě uvážení lékaře ED podávána další léčba adrenergními a anticholinergními bronchodilatátory a glukokortikoidy a přehodnocována každou hodinu. Pokud následně splní kritéria propuštění, jsou propuštěni. Pokud ne, jsou přijati do nemocnice. Bylo zjištěno, že míra falešně pozitivních přijetí s těmito algoritmy je nižší než 1 % a míra 24hodinového relapsu nižší než 2 %.

Studují se pouze jedinci, u kterých byla indexová návštěva ED pro léčbu akutního astmatického záchvatu. Pacienti s anamnézou naznačující městnavé srdeční selhání, pneumonii, chronickou bronchitidu nebo emfyzém jsou vyloučeni.

Venózní krev bude odebrána 1250 subjektům. Očekává se, že 25 % bude mít obstrukci, která špatně reaguje na albuterol a bude vyžadovat přijetí do nemocnice k vyřešení. Zbylých 75 % bude mít obstrukci, která rychle odezní albuterolem a kteří budou propuštěni domů. DNA bude izolována a slepě testována Centrem pro výzkum lidské genetiky, Vanderbilt Medical Center pro identifikaci β2 AR SNP na pozicích 16 a 27 a receptorových haplotypů. Jednonukleotidové polymorfismy budou genotypovány pomocí TaqMan testů genotypizace jednonukleotidového polymorfismu (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Pro genotypizaci bude vybráno 11 polymorfismů z kódující oblasti ADRB2 a až do přibližně 5 kb 5' kodonu 1 (rs11958940, rs17778257, rs2895795, rs2053044, rs12654778, 12654778, 1271 rs11978, 1271 rs11940 rs1042714, rs1800888 a rs1042718). Měřítka kontroly kvality zahrnují míru volání genotypu 95 % a žádné významné odchylky od Hardy-Weinbergovy rovnováhy v rámci každé rasové skupiny (přesná hodnota p > 0,01). Haplotypy budou predikovány pomocí veřejně dostupného softwaru (SNPHNP-program pro odhad četností velkých haplotypů jednonukleotidových polymorfismů [verze 1.3]). Hodnoceny budou haplotypové páry 2/2, 2/4, 2/6, 4/4, 4/6 a 6/6.

Primární výslednou proměnnou budou genetické vzorce (SNP a haplotypy) v každé populaci. Chceme vyhodnotit vzorce SNP a schopnost reagovat na albuterol pomocí případové kontrolní studie. Srovnání mezi skupinami bude provedeno analýzou kovariance. Asociace mezi výchozí hodnotou PEFR a procentem zlepšení po albuterolu budou stratifikovány pro vzorec SNP a budou hodnoceny analýzou kovariance. Jednotlivé polymorfismy mohou být nedostatečné a bylo navrženo, že haplotypy obsahující více polymorfismů mohou být informativnější. Drysdale a spolupracovníci identifikovali 13 polymorfismů a uspořádali je do 12 haplotypových skupin s různou frekvencí mezi etnickými skupinami. Čtyři nejčastější byly haplotypy 1, 2, 4 a 6. Haplotyp 2, který obsahuje homozygoty Gly16, byl spojen s největším FEV1, reverzibilita, zatímco haplotyp 4, který obsahuje homozygoty Arg16, byl nejmenší. U astmatiků bylo běžných pět haplotypových párů. Homozygoti, haplotypy 2/2 měli největší vliv na FEV1 a expresi proteinů, zatímco haplotypový pár 4/4 vykazoval nejmenší účinek v obou kategoriích. Protože žádný izolovaný SNP nemusí mít žádnou prediktivní užitečnost, proto měříme haplotypy. Haplotypová kombinace 4/4 má nejmenší dopad a může být funkční u nereagujících. Haplotypový pár 4/6 produkuje největší zlepšení s albuterolem, a proto může být funkční v responzivní skupině.

Odhadneme frekvence haplotypů napříč skupinou studovaných pacientů. Pomocí logistické regrese vypočítáme statistiku globálního skóre pro celkovou asociaci mezi haplotypy a citlivostí na albuterol. Dále budou vypočtena haplotypově specifická skóre a odpovídající p-hodnoty. Podobné statistiky budou vypočítány s úpravou pro základní kovariáty. Tyto analýzy budou provedeny pomocí R funkcí v haplo.stats.

Budeme hodnotit asociace haplotypů 1-6 s odpovědí/neodpovědí na adrenergní agonisty pomocí případové a kontrolní studie. S použitím dat v tabulce 1 a za předpokladu, že případy tvoří 25 % studovaných subjektů, a pomocí funkce haplo.power.cc. Požadujeme velikost vzorku 1243 pacientů, abychom byli schopni detekovat alespoň 40% zvýšení rizika nereagující na adrenergní agonisty u pacientů s haplotypy obsahujícími Arg16Arg ve srovnání s haplotypy bez Arg16Arg s 80% silou na hladině významnosti 0,05. Za podobných předpokladů požadujeme celkovou velikost vzorku 865, abychom byli schopni detekovat 50% zvýšení rizika selhání léčby u pacientů s haplotypy obsahujícími Arg16Arg ve srovnání s pacienty bez. Počet subjektů představuje celkový počet potřebný k dosažení dostatečného výkonu při poměru úspěšnosti a neúspěchu léčby 75:25.

Výsledky této studie prokážou, zda genotypy Gly16Arg nebo Gln27Glu a/nebo haplotypy β2AR jsou spojeny s odpovědí na albuterol u pacientů s akutními epizodami astmatu a zda se genotypový vzorec liší mezi různými klinickými fenotypy. Poskytnou také pohled na to, zda tyto polymorfismy určují závažnost epizod měřenou počáteční plicní funkcí a symptomy. V tomto šetření by byly mimořádně důležité pozitivní i negativní výsledky. Pozitivní zjištění by naznačovala, že můžeme začít chápat smysl z terapeutické odezvy na velmi základní úrovni. Naznačují také, že musíme začít hledat alternativní způsoby léčby pro významnou část astmatické populace, když akutně onemocní. Stejně důležité to znamená, že naše úsilí o kontrolu astmatu již nemusí být aplikováno difúzně, ale nyní se může zaměřit na profylaxi u postižených jedinců. Negativní nálezy přesvědčivě prokáží, že geneticky podmíněné změny v B2AR nelze snadno převést do klinických odpovědí a že musíme hledat další faktory, které určují závažnost a využití zdrojů v populaci nereagující na beta2.