Průzkumná studie molekulární patologie plicní fibrózy kombinací klinického hodnocení a systémové biologie

Pozadí

Po dosažení dospělosti si orgány lidského těla zachovávají svůj tvar a funkci po dlouhou dobu, čímž se řízená oprava stává jedním z nejdůležitějších mechanismů po celý život. Pravidelné hojení ran po úrazu sestává z dobře uspořádaného sledu překrývajících se fází: zánět, tvorba nové podpůrné tkáně, reepitelizace a konečná regenerace buněk epitelu a výstelky endotelu a v podstatě opakuje složitý proces vývoje orgánů. U mladých dospělých je poškození orgánu často zodpovězeno plně regeneračním hojením ran, opakujícími se mechanismy růstu embryonálních orgánů nazývanými "primární" hojení ran. Opakované poškození u mladších jedinců může způsobit "sekundární" hojení ran ve formě tvorby jizev sloužících jako záchranný program k udržení integrity povrchu, jakmile selže reorganizace epitelu a/nebo endotelu.

Orgánové selhání ve stárnoucím organismu je však jiné a v podstatě představuje ztrátu jeho schopnosti dosáhnout řádné reaktivace vývoje orgánů. Tato odlišná kvalita hojení ran spočívá v kombinaci chronického zánětu a fibroproliferativní, neregenerační opravy. Jeho patologie se týká velké skupiny onemocnění zahrnujících každý orgán lidského těla.

V plicích je jeho nejvýznamnější forma charakterizována dobře definovanou histopatologií nazývanou obvyklá intersticiální pneumonie (UIP). Bohužel tato histopatologie, přestože identifikuje zvláště agresivní fenotyp samotné fibroproliferativní reparační odpovědi, neumožňuje jednoznačnou klinickou diagnózu, protože „vzorec“ UIP lze nalézt u různých fibrotických onemocnění plic, jako je hypersenzitivní pneumonitida (HP ), zejména v chronické formě.

Kromě toho různé mechanismy zánětu, které částečně souvisejí se samotnou reakcí na hojení ran, mohou hluboce zesílit aberantní reakci na hojení ran. V důsledku toho nejsou známy mechanismy vedoucí k tomuto stavu a udržení jeho charakteristického klinického vzhledu.

Aktuální šetření patří do pracovního balíčku 2 studijního systému RESOLVE (FP7-HEALTH-F4-2008 Smlouva č. 202047), který obsahuje protokol klinické studie hodnotící různé formy fibrotické opravy v lidských plicích. Hlavním cílem RESOLVE je identifikovat a charakterizovat klinicky ověřené molekulární cíle schopné posunout primární opravu orgánů směrem k fibroproliferativnímu hojení ran. V této pilotní studii budou různé formy reparace plic prospektivně analyzovány pomocí souběžné klinické a biologické analýzy vedené vyhodnocenými funkčními a radiologickými měřítky klinického vývoje. Hodnocení bude provedeno na začátku období studie (návštěva 1), po třech měsících prospektivního pozorování (návštěva 2) a po 12 měsících (konec studie), což umožní klinicky relevantní korelaci všech získaných biologických dat.

Pro systematickou biologickou analýzu budou vybrány tři obecné podmínky opravy v důsledku jejich klinické diagnózy (histopatologie, radiologie) a jejich souvislosti s věkem:

• Obvyklá intersticiální pneumonie (UIP) vyskytující se téměř výhradně ve věku 55-80 let,
• Hypersenzitivní pneumonitida (HP), akutní i chronická, vyskytující se ve věku 20–55 let a
• Normální oprava u mladých (18-40 let) a starých (starších než 55 let) jedinců.

Metody

Po zajištění diagnózy (viz níže: kritéria pro zařazení/vyloučení) a po informovaném souhlasu během screeningové návštěvy dostanou pacienti bez předchozí imunosupresivní léčby (pacienti dosud neléčení) imunosupresivní léčbu prednisolonem (denní dávka 1 mg/kg tělesné hmotnosti ) po dobu alespoň tří měsíců, aby se vyloučily patologické stavy ovládané mechanismy zánětu. Během screeningové návštěvy budou zajištěny výsledky histopatologického rozboru a zaznamenána klinická a funkční anamnéza onemocnění. To bude zahrnovat předchozí medikaci, výsledky předchozích plicních funkčních testů (PFT) a také výsledky radiologické analýzy (počítačová tomografie včetně HR-CT) a laboratorních testů (s výjimkou kolagenového vaskulárního onemocnění a zajištění sérologie HP).

Tři měsíce po screeningové návštěvě, při návštěvě 1, bude znovu hodnoceno funkční a radiologické stadium plicní fibrózy a pacienti budou nakonec zařazeni do studie. V souladu se zjištěními získanými při screeningové návštěvě a vzhledem k funkčním a radiologickým výsledkům získaným při návštěvě 1 budou pacienti rozděleni do následujících výzkumných skupin:

Skupina A:

(Limited UIP) Pacienti s prokázanou UIP a funkčně a radiologicky méně pokročilou plicní fibrózou (n=12) definovanou histopatologií (hodnocení dvěma nezávislými a zkušenými patology, kteří se studie nezapojili) a/nebo radiologií (skenování počítačovou tomografií [CT] vč. CT s vysokým rozlišením, nezávisle hodnocené zkušeným radiologem, který není zapojen do studie) a testy funkce plic (PFT). PFT se bude skládat ze spirometrie, měření bodypletysmografem, měření kapacity difúze oxidu uhelnatého jedním dechem a komplexního kardiopulmonálního zátěžového testování včetně hodnocení plicní ventilace a výměny plynů v klidu a při námaze;

Skupina B:

(Pokročilá UIP) Pacienti s prokázanou UIP (n=12) ve významně pokročilejším stádiu onemocnění, jak bylo stanoveno pomocí PFT (FVC alespoň 10 procent a DLCO alespoň o 15 procent nižší než ve skupině A) a CT vyšetření;

Skupina C:

(Chronická fibrotizující hypersenzitivní pneumonitida, HP) Pacienti s chronickou fibrotizující HP (n=12) diagnostikovaní histopatologicky, radiologicky a laboratorními testy;

Skupina D:

(Akutní HP) Pacienti s akutní HP (n=9) diagnostikovaní histopatologicky, radiologicky a laboratorním vyšetřením (Skupina D: akutní HP);

Skupina E:

Pravidelná plicní oprava 9 mladých (18-40 let) bez jakékoli klinicky zjevné patologie a 9 starých dobrovolníků (55-80 let) bez plicní fibrózy bude sloužit jako kontrola.

Všichni pacienti s UIP a HP budou sledováni po dobu studie 12 měsíců. Období studia začíná návštěvou 1. Kromě návštěvy 1 budou provedeny dvě další návštěvy po 3 měsících (návštěva 2, funkční hodnocení) a po 12 měsících (návštěva 3, konec studie).

Při všech třech návštěvách budou provedena následující vyšetření:

• Klinické vyšetření
• EKG
• PFT
• Kardiopulmonální zátěžový test
• Odběr krve
• CT vyšetření
• Bronchoskopie s odebráním 5 transbronchiálních biopsií pro biologické posouzení z oblastí naznačujících maximální aktivitu onemocnění při CT vyšetření bude provedena pouze při návštěvách 1 a 3.

Příslušná kritéria pro zařazení platná pro skupinu A (omezené UIP):

• Informovaný souhlas
• Histologický průkaz lézí konzistentních s UIP v chirurgických plicních biopsiích a/nebo
• Radiologické známky svědčící pro UIP
• Žádné známky rozšířených zákalů na CT vyšetřeních
• Žádné příznaky naznačující chronickou bronchitidu/bronchiolitidu, jako je kašel a známky bronchiální obstrukce nebo hyperinflace
• Předpokládaný rozdíl hodnot vitální kapacity usilovného výdechu (FVC) ≤ 10 % oproti normálu
• Rozdíl v kapacitě difúze oxidu uhelnatého (DLCO) v klidu ≤ 15 % předpokládané k normálu
• Předchozí nebo současná léčba imunosupresivy

Relevantní kritéria pro zařazení platná pro skupinu B (pokročilý UIP) (jiná než skupina A):

• Známky rozšířených zákalů zabroušeného skla při CT vyšetřeních
• Mohou být přítomny příznaky připomínající chronickou bronchitidu, jako je kašel a známky bronchiální obstrukce nebo hyperinflace
• Hodnoty vitální kapacity usilovného výdechu (FVC) v rozdílu > 10 % předpokládané k normálu
• Předpokládané snížení kapacity difúze oxidu uhelnatého (DLCO) v klidu < 15 %.

Příslušná kritéria pro zařazení platná pro skupinu C:

• Informovaný souhlas
• Histologický a/nebo cytologický průkaz lézí konzistentních s chronickou HP v transbronchiálních a/nebo chirurgických plicních biopsiích, transbronchiálních biopsiích nebo vzorcích bronchoalveolární laváže (BAL)
• Radiologické příznaky svědčící pro chronickou HP
• Známky rozšířených zákalů zabroušeného skla při CT vyšetřeních
• Mohou být přítomny příznaky naznačující aktivní bronchitidu/bronchiolitidu, jako je kašel a známky bronchiální obstrukce nebo hyperinflace
• Sérologický průkaz přecitlivělosti, pokud je to možné
• Hodnoty vitální kapacity nuceného výdechu (FVC) v rozdílu ≥ 10 % předpokládané k normálu
• Předpokládané snížení kapacity difúze oxidu uhelnatého (DLCO) v klidu o ≥ 15 %
• Předchozí nebo současná léčba imunosupresivy

Příslušná kritéria pro zařazení platná pro skupinu D (jiná než skupina C):

• Informovaný souhlas
• Histologický a/nebo cytologický průkaz lézí konzistentních s akutní HP ve vzorcích transbronchiálních a biopsií a/nebo bronchoalveolární laváže (BAL)
• Radiologické známky svědčící pro akutní HP

Obecná vylučovací kritéria

• Funkčně významná kardiovaskulární morbidita
• Respirační nedostatečnost (PaO2 < 55 mmHg; PaCO2 > 50 mmHg)
• Významná plicní hypertenze
• Významný plicní emfyzém
• Nefunkční kontralaterální plíce
• Rakovina
• Významná ischemická choroba srdeční
• Koagulační dysfunkce
• Těhotenství nebo plánování těhotenství během studie nebo do tří měsíců poté
• Známé zneužívání drog nebo alkoholu do 3 let od screeningu
• Předpokládaná neshoda
• Známá právní nezpůsobilost nebo omezená právní způsobilost při screeningu

Biopsie

Vzorky plic pro biologickou analýzu budou získány jak z diagnostických chirurgických plicních biopsií, tak z transbronchiálních plicních biopsií odebraných během bronchoskopií provedených při návštěvě 1 a 3. Celkem bude při každé návštěvě odebráno pět transbronchiálních biopsií pro biologickou analýzu. Všechny transbronchiální vzorky plic budou odebrány pod radiologickou kontrolou z periferních oblastí plic dříve specifikovaných v souladu s nejnovějším CT vyšetřením. Biopsie odebrané při návštěvě 3 budou provedeny ve stejném segmentu plic jako biopsie odebrané při návštěvě 1.

Kromě výsledků posledního CT vyšetření bude zkoušející provádějící bronchoskopii zaslepený pro všechny klinické výsledky získané během návštěv.

Hodnocení molekulární biologie

Biologická analýza bude provedena nezávisle. Všichni vyšetřovatelé zapojení do biologické analýzy budou zaslepeni pro diagnózu a klinický průběh pacientů a dobrovolníků. Účastníci budou identifikovatelní výhradně podle studijního identifikačního čísla (ID). Vzorky studie budou očíslovány podle ID pacienta a popisu vzorku poskytnutého LIMS. Biologické hodnocení bude zahrnovat měření transkriptomiky celého genomu, analýzu proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie a EIA, analýzu stavu metylace DNA a analýzu mikroRNA. Měření budou založena na plicních vzorcích získaných z diagnostických chirurgických plicních biopsií, pokud je to možné, a/nebo z transbronchiálních biopsií (TbX) odebraných během bronchoskopie při návštěvě 1 a 3 studie (měsíc 0 a měsíc 12). Kromě toho bude kapalina BAL skladována a používána pro detekci proteinů a lipidů. Materiály pro analýzu metylace DNA budou získány ze vzorků plicní tkáně a plné krve.