Eksploracyjne badanie patologii molekularnej zwłóknienia płuc poprzez połączenie oceny klinicznej i biologii systemowej

Tło

Po osiągnięciu dorosłości narządy organizmu człowieka zachowują swój kształt i funkcję przez długi czas, dzięki czemu ukierunkowana naprawa jest jednym z najważniejszych mechanizmów w ciągu całego życia. Regularne gojenie się ran po urazie składa się z dobrze uporządkowanej sekwencji zachodzących na siebie faz: zapalenia, tworzenia nowej tkanki podporowej, ponownego nabłonka i ostatecznej regeneracji komórek nabłonka i wyściółki śródbłonka, i zasadniczo powtarza złożony proces rozwoju narządu. U młodych dorosłych uszkodzenie narządu jest często reakcją na w pełni regenerujące się gojenie się ran, powtarzające się mechanizmy wzrostu narządu embrionalnego, zwane „pierwotnym” gojeniem się ran. Powtarzające się uszkodzenia u młodszych osób mogą powodować „wtórne” gojenie się ran w postaci powstawania blizn, służące jako program ratunkowy mający na celu utrzymanie integralności powierzchni po niepowodzeniu reorganizacji nabłonka i/lub śródbłonka.

Niewydolność narządów w starzejącym się organizmie jest jednak inna i zasadniczo oznacza utratę zdolności do osiągnięcia uporządkowanej reaktywacji rozwoju narządów. Ta odmienna jakość gojenia się ran polega na połączeniu przewlekłego stanu zapalnego i fibroproliferacyjnej, nieregeneracyjnej naprawy. Jej patologia odnosi się do dużej grupy chorób obejmujących każdy narząd ludzkiego ciała.

W płucach jego najbardziej widoczna postać charakteryzuje się dobrze zdefiniowaną histopatologią zwaną zwykłym śródmiąższowym zapaleniem płuc (UIP). Niestety ta histopatologia, identyfikując szczególnie agresywny fenotyp samej odpowiedzi naprawczej fibroproliferacji, nie pozwala na postawienie jednoznacznej diagnozy klinicznej, ponieważ „wzorzec” UIP można znaleźć w różnych chorobach zwłóknieniowych płuc, takich jak zapalenie płuc z nadwrażliwości (HP ), zwłaszcza w postaci przewlekłej.

Ponadto różne mechanizmy zapalenia, które są częściowo związane z samą reakcją na gojenie się rany, mogą głęboko nasilać nieprawidłową odpowiedź na gojenie się rany. W rezultacie nie są znane mechanizmy prowadzące do tego stanu i utrzymania jego charakterystycznego obrazu klinicznego.

Bieżące badanie należy do pakietu roboczego 2 systemu badawczego RESOLVE (FP7-HEALTH-F4-2008 Umowa nr. 202047), który zawiera protokół badania klinicznego oceniający różne formy naprawy włóknistej w płucach człowieka. Głównym celem projektu RESOLVE jest identyfikacja i scharakteryzowanie klinicznie potwierdzonych celów molekularnych zdolnych do przesunięcia pierwotnej naprawy narządów w kierunku gojenia się ran fibroproliferacyjnych. W tym badaniu pilotażowym różne formy naprawy płuc zostaną przeanalizowane prospektywnie za pomocą jednoczesnej analizy klinicznej i biologicznej, na podstawie ocenianych funkcjonalnych i radiologicznych wskaźników rozwoju klinicznego. Oceny będą dokonywane na początku okresu badania (wizyta 1), po trzech miesiącach prospektywnej obserwacji (wizyta 2) i po 12 miesiącach (koniec badania) pozwalając na klinicznie istotną korelację wszystkich uzyskanych danych biologicznych.

Trzy ogólne warunki naprawy zostaną wybrane do systematycznej analizy biologicznej w wyniku ich diagnozy klinicznej (histopatologia, radiologia) i ich związku z wiekiem:

• Zwykłe śródmiąższowe zapalenie płuc (UIP) występujące prawie wyłącznie w wieku 55-80 lat,
• Nadwrażliwość Pneumonitis (HP), zarówno ostra, jak i przewlekła, występująca w wieku 20-55 lat i
• Normalna naprawa u osób młodych (18-40 lat) i starszych (powyżej 55 lat).

Metody

Po ustaleniu rozpoznania (patrz poniżej: kryteria włączenia/wyłączenia) i uzyskaniu świadomej zgody podczas wizyty przesiewowej, pacjenci nieleczeni wcześniej immunosupresyjnie (pacjenci dotychczas nieleczeni) otrzymają terapię immunosupresyjną prednizolonem (dzienna dawka 1 mg/kg mc. ) przez co najmniej trzy miesiące w celu wykluczenia patologii zdominowanych przez mechanizmy zapalne. Podczas wizyty przesiewowej zostaną zabezpieczone wyniki badania histopatologicznego oraz odnotowany zostanie kliniczny i czynnościowy przebieg choroby. Obejmuje to wcześniejsze leki, wyniki wcześniejszych badań czynnościowych płuc (PFT), a także wyniki analizy radiologicznej (tomografia komputerowa, w tym HR-CT) i badań laboratoryjnych (wykluczenie choroby naczyń kolagenowych i zabezpieczanie serologii HP).

Trzy miesiące po wizycie przesiewowej, na wizycie 1, ponownie oceniony zostanie etap czynnościowy i radiologiczny włóknienia płuc, a pacjenci zostaną ostatecznie włączeni do badania. Zgodnie z ustaleniami uzyskanymi podczas wizyty przesiewowej oraz wynikami czynnościowymi i radiologicznymi uzyskanymi podczas pierwszej wizyty, pacjenci zostaną podzieleni na następujące grupy badawcze:

Grupa A:

(Ograniczony UIP) Pacjenci z potwierdzonym UIP oraz mniej zaawansowanym funkcjonalnie i radiologicznie zwłóknieniem płuc (n=12) zdefiniowanym na podstawie badania histopatologicznego (ocena dokonana przez dwóch niezależnych i doświadczonych patologów nieuczestniczących w badaniu) i/lub radiologicznego (tomografia komputerowa [CT]) w tym TK o wysokiej rozdzielczości, niezależnie ocenione przez doświadczonego radiologa nie biorącego udziału w badaniu) oraz testy czynnościowe płuc (PFT). PFT składać się będzie ze spirometrii, pomiaru pletyzmografem ciała, pomiaru pojemności dyfuzyjnej tlenku węgla w jednym oddechu oraz pełnej próby wysiłkowej krążeniowo-oddechowej obejmującej ocenę wentylacji płuc i wymiany gazowej w spoczynku i podczas wysiłku;

Grupa B.:

(Advanced UIP) Chorzy z potwierdzonym UIP (n=12) w istotnie bardziej zaawansowanym stadium choroby określanym na podstawie PFT (FVC co najmniej 10 proc. i DLCO co najmniej 15 proc. mniej niż w grupie A) i tomografii komputerowej;

Grupa C:

(Przewlekłe zapalenie płuc z nadwrażliwością z włóknieniem, HP) Pacjenci z przewlekłym włóknieniem HP (n=12) zdiagnozowanym na podstawie badań histopatologicznych, radiologicznych i laboratoryjnych;

Grupa D.:

(Ostra HP) Pacjenci z ostrą HP (n=9) rozpoznaną na podstawie histopatologii, radiologii i badań laboratoryjnych (Grupa D: ostra HP);

Grupa E:

Regularna naprawa płuc 9 młodych (w wieku 18-40 lat) bez jakiejkolwiek jawnej klinicznie patologii i 9 starych ochotników (w wieku 55-80 lat) bez zwłóknienia płuc będzie służyć jako kontrola.

Wszyscy pacjenci z UIP i HP będą obserwowani przez okres badania wynoszący 12 miesięcy. Okres nauki rozpoczyna się od wizyty 1. Oprócz wizyty 1 odbędą się dwie dodatkowe wizyty po 3 miesiącach (wizyta 2, ocena funkcjonalna) i po 12 miesiącach (wizyta 3, zakończenie badania).

Podczas wszystkich trzech wizyt zostaną przeprowadzone następujące badania:

• Badanie kliniczne
• EKG
• PFT
• Test wysiłkowy krążeniowo-oddechowy
• Rysunek krwi
• tomografia komputerowa
• Bronchoskopia z usunięciem 5 biopsji przezoskrzelowych do oceny biologicznej z obszarów sugerujących maksymalną aktywność choroby w tomografii komputerowej zostanie wykonana tylko na wizytach 1 i 3.

Odpowiednie kryteria włączenia mające zastosowanie do grupy A (ograniczony UIP):

• Świadoma zgoda
• Histologiczne potwierdzenie zmian zgodnych z UIP w chirurgicznych biopsjach płuc i/lub
• Objawy radiologiczne sugerujące UIP
• Brak oznak rozległych zmętnień szkła matowego w tomografii komputerowej
• Brak objawów sugerujących przewlekłe zapalenie oskrzeli/zapalenie oskrzelików, takich jak kaszel i objawy niedrożności oskrzeli lub hiperinflacji
• Różnica wartości natężonej wydechowej pojemności życiowej (FVC) ≤ 10% wartości przewidywanej względem normy
• Różnica zdolności dyfuzyjnej tlenku węgla (DLCO) w spoczynku ≤ 15% przewidywanej do normalnej
• Wcześniejsze lub obecne leczenie lekami immunosupresyjnymi

Odpowiednie kryteria włączenia mające zastosowanie do grupy B (zaawansowany UIP) (innej niż grupa A):

• Oznaki rozległych zmętnień szkła matowego w tomografii komputerowej
• Mogą wystąpić objawy sugerujące przewlekłe zapalenie oskrzeli, takie jak kaszel i objawy niedrożności lub hiperinflacji oskrzeli
• Wartości natężonej wydechowej pojemności życiowej (FVC) różnią się > 10% wartości przewidywanej od normy
• Zmniejszenie zdolności dyfuzyjnej tlenku węgla (DLCO) w stanie spoczynku o < 15% prognozy

Odpowiednie kryteria włączenia mające zastosowanie do grupy C:

• Świadoma zgoda
• Histologiczne i/lub cytologiczne potwierdzenie zmian zgodnych z przewlekłym HP w próbkach przezoskrzelowych i/lub chirurgicznych biopsji płuc, biopsji przezoskrzelowych lub próbkach z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL)
• Objawy radiologiczne sugerujące przewlekłą HP
• Oznaki rozległych zmętnień szkła matowego w tomografii komputerowej
• Mogą wystąpić objawy wskazujące na aktywne zapalenie oskrzeli/zapalenie oskrzelików, takie jak kaszel i objawy niedrożności lub hiperinflacji oskrzeli
• Serologiczny dowód nadwrażliwości, jeśli to możliwe
• Wartości natężonej wydechowej pojemności życiowej (FVC) różnią się o ≥ 10% od normy
• Zmniejszenie zdolności dyfuzyjnej tlenku węgla (DLCO) w spoczynku o ≥ 15% wartości przewidywanej
• Wcześniejsze lub obecne leczenie lekami immunosupresyjnymi

Odpowiednie kryteria włączenia mające zastosowanie do grupy D (innej niż grupa C):

• Świadoma zgoda
• Histologiczne i/lub cytologiczne potwierdzenie zmian zgodnych z ostrym HP w próbkach przezoskrzelowych i biopsyjnych i/lub popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL)
• Objawy radiologiczne sugerujące ostrą HP

Ogólne kryteria wykluczenia

• Funkcjonalnie istotna chorobowość sercowo-naczyniowa
• Niewydolność oddechowa (PaO2 < 55 mmHg; PaCO2 > 50 mmHg)
• Znaczne nadciśnienie płucne
• Znaczna rozedma płuc
• Niefunkcjonalne płuco kontralateralne
• Rak
• Poważna choroba niedokrwienna serca
• Zaburzenia krzepnięcia
• Ciąża lub planowanie ciąży w trakcie badania lub w okresie trzech miesięcy po jego zakończeniu
• Znane nadużywanie narkotyków lub alkoholu w ciągu 3 lat od badania przesiewowego
• Domniemana niezgodność
• Znana niezdolność do czynności prawnych lub ograniczona zdolność do czynności prawnych podczas badania przesiewowego

Biopsje

Próbki płuc do analizy biologicznej będą pochodzić zarówno z diagnostycznych biopsji chirurgicznych płuc, jak i przezoskrzelowych biopsji płuc pobranych podczas bronchoskopii wykonywanych na wizycie 1 i 3. W sumie podczas każdej wizyty zostanie pobranych pięć biopsji przezoskrzelowych do analizy biologicznej. Wszystkie próbki płuc przezoskrzelowych zostaną usunięte pod kontrolą radiologiczną z obwodowych obszarów płuc uprzednio określonych zgodnie z ostatnim tomografem komputerowym. Biopsje pobrane podczas wizyty 3 zostaną wykonane w tym samym segmencie płuc, co biopsje pobrane podczas wizyty 1.

Z wyjątkiem wyników ostatniego badania TK, badacz wykonujący bronchoskopię będzie zaślepiony na wszystkie wyniki kliniczne uzyskane podczas wizyt.

Ocena biologii molekularnej

Analiza biologiczna zostanie przeprowadzona niezależnie. Wszyscy badacze zaangażowani w analizę biologiczną będą zaślepieni na diagnozę i przebieg kliniczny pacjentów i ochotników. Uczestnicy będą identyfikowani wyłącznie na podstawie numeru identyfikacyjnego badania (ID). Próbki do badań zostaną ponumerowane zgodnie z identyfikatorem pacjenta i opisem próbki dostarczonym przez LIMS. Ocena biologiczna będzie obejmować pomiar transkryptomiki całego genomu, analizę białek za pomocą spektrometrii mas i EIA, analizę statusu metylacji DNA oraz analizę mikroRNA. Pomiary będą oparte na próbkach płuc pochodzących z diagnostycznych biopsji chirurgicznych płuc, jeśli to możliwe, i/lub z biopsji przezoskrzelowych (TbX) pobranych podczas bronchoskopii podczas wizyty 1 i 3 badania (miesiąc 0 i miesiąc 12). Ponadto płyn BAL będzie przechowywany i wykorzystywany do wykrywania białek i lipidów. Materiały do ​​analizy metylacji DNA będą pozyskiwane zarówno z próbek tkanki płucnej, jak i krwi pełnej.