Klinická metagenomika infekční endokarditidy (Meta-ENDO)

Pozadí a odůvodnění Infekční endokarditida (IE) je infekce srdečních chlopní. IE se týká především bakterií, vzácněji plísní. IE je vzácné onemocnění s odhadovaným výskytem 1-12 případů na 100 000 obyvatel za rok. Diagnostika IE spočívá v odběru biologických vzorků (krevní kultury a peroperační vzorky) a jejich kultivaci v bakteriologické laboratoři, označované jako konvenční metody.

Tento proces, prakticky nezměněný od dob Pasteura na konci 19. století, má nevýhodu v tom, že umožňuje jedinou detekci bakterií, které lze pěstovat za obvyklých podmínek laboratoře. Pokud to většina patogenních bakterií dokáže, některé bakterie, které se mohou podílet na IE (např. Coxiella sp., Bartonella sp., Tropheryma whipplei), vyžadují velmi specifické podmínky pro množení. Navíc předchozí příjem antibiotik pacientem před odběrem vzorku může negativně ovlivnit kultivaci vzorků. Diagnóza IE je vyvolána zvážením řady klinických argumentů (horečka, mikrobiologické rizikové chování (pozitivní hemokultury), sérologie (pro Coxiella burnettii), echografie (přítomnost intrakardiální hmoty, absces, prosakování a/nebo vyjmutí chlopně), z nichž všechny jsou vedlejšími a hlavními kritérii pro stanovení jistoty IE. Léčba IE je založena na prodloužených antibiotikách (ve většině případů 4 až 6 týdnů) a operaci chlopní (podle přesných indikací).

Asi v 10 % případů však hemokultury zůstávají negativní. Ty jsou známé jako negativní kultivační IE, což může být způsobeno antibiotiky odebranými před odběrem vzorků, nekultivovatelnými bakteriemi nebo aseptickými jevy. Pak lze použít širokorozsahovou PCR, která sestává z amplifikace pomocí PCR a poté sekvenování frakce genu kódujícího 16S RNA. Umožňuje identifikaci patogenní bakterie, ale neposkytuje informaci o případné rezistenci na antibiotika.

Koncepce klinické metagenomiky Klinická metagenomika je definována jako aplikace vysoce výkonného sekvenování (NGS) s následnou specifickou bioinformatickou analýzou k získání klinických informací, tj. identifikace patogenů a predikce jejich citlivosti na antimikrobiální látky. Metagenom vzorku (tj. všechny genomy přítomných organismů) prakticky obsahuje všechny informace potřebné pro bakteriologickou diagnostiku: co je/jsou patogenní bakterie (bakterie) a na která antibiotika jsou/jsou citlivé. Koncept klinické metagenomiky se vyvíjel souběžně s novými technologiemi sekvenování DNA zavedenými v polovině 21. století a je mnohem efektivnější z hlediska propustnosti než metoda sekvenování popsaná Sangerem. I když je tento koncept atraktivní, stále existuje mnoho překážek pro jeho realizaci. Za prvé, klinické vzorky z bakteriálních infekcí obvykle obsahují vysokou koncentraci leukocytů, jejichž genom je asi 1000krát větší než genom bakterií. Prvním limitujícím krokem pro klinickou metagenomiku je tedy potřeba získat dostatečné množství bakteriální DNA, aby bylo možné připravit kvalitní knihovny pro sekvenování, ale také snížit koncentraci lidské DNA, jejíž sekvenování je v tomto kontextu zbytečné. Metody jsou dostupné, ale je nutné jejich vyhodnocení pro účely klinické metagenomiky. Zadruhé, složitost bioinformatických dat, která mají být spravována mikrobiologem, vyžaduje, aby data byla využívána co nejvíce automatizovaně spolu s uživatelsky přívětivým rozhraním, což dnes není případ, i když se vyvíjejí online platformy. Taxonomické přiřazení sekvencí, jejich sestavení, identifikace genů a chromozomálních mutací spojených s antibiotickou rezistencí a vytvoření vazby mezi determinantou rezistence a hostitelskou bakterií jsou dalšími překážkami pro implementaci klinické metagenomiky. A konečně, pokud čas potřebný k získání výsledků, které může mikrobiolog využít, má tendenci se zkracovat, je nyní srovnatelný s časem kultivace za mnohem vyšší náklady. Trvalá konkurence mezi výrobci sekvencerů by však měla udržet jejich pokles, jak tomu bylo v posledním desetiletí.

Význam použití klinické metagenomiky u IE

Použití klinické metagenomiky v kontextu IE se proto zdá relevantní z několika důvodů:

• Většina IE je monomikrobiálních, což podle našich předběžných výsledků podporuje dobrý výkon klinické metagenomiky.
• Kultivace intraoperačních vzorků provedená v souvislosti s IE je někdy negativní kvůli předléčení antibiotiky a/nebo nekultivaci za rutinních podmínek patogenu (např. Bartonella spp. nebo Coxiella spp.), což ponechává prostor pro zlepšení.
• Léčba IE je dlouhodobá léčba, která vyžaduje přesnou diagnózu v souladu s citlivostí patogenů k antibiotikům. Pokud není patogen nalezen v kultuře, měla by být pacientovi podána širokospektrá antibiotika s dvojnásobným rizikem selhání léčby a toxicity. Klinická metagenomika by však mohla poskytnout informace o citlivosti na antibiotika i v případě negativní kultivace.
• Mikrobiologická diagnostika IE není ve většině případů urgentní diagnózou, což je kompatibilní s využitím klinické metagenomiky, u níž je doba realizace v nejlepším případě 48-72h.

Proto navrhujeme posoudit výkon klinické metagenomiky v diagnostice IE.