Metagenomika kliniczna infekcyjnego zapalenia wsierdzia (Meta-ENDO)

Wstęp i uzasadnienie Infekcyjne zapalenie wsierdzia (IE) jest zakażeniem zastawek serca. IZW obejmuje głównie bakterie, rzadziej grzyby. IZW jest chorobą rzadką, szacowaną na 1-12 przypadków na 100 000 mieszkańców rocznie. Diagnostyka IZW polega na pobraniu materiału biologicznego (posiewy krwi i próbki pooperacyjne) i ich hodowli w laboratorium bakteriologicznym, określanych jako metody konwencjonalne.

Proces ten, praktycznie niezmieniony od czasów Pasteura pod koniec XIX wieku, ma tę wadę, że umożliwia jedynie wykrywanie bakterii, które można hodować w zwykłych warunkach laboratoryjnych. Jeśli większość bakterii chorobotwórczych to potrafi, niektóre bakterie, które mogą być zaangażowane w IZW (np. Coxiella sp., Bartonella sp., Tropheryma whipplei) wymagają bardzo specyficznych warunków do namnażania się. Ponadto wcześniejsze przyjęcie przez pacjenta antybiotyków przed pobraniem próbki może negatywnie wpłynąć na hodowlę próbek. Rozpoznanie IZW stawia się na podstawie szeregu argumentów klinicznych (gorączka, ryzykowne zachowania mikrobiologiczne (dodatnie posiewy krwi), serologia (w kierunku Coxiella burnettii), echoografia (obecność guza wewnątrzsercowego, ropień, wyciek i/lub usunięcie zastawki), z których wszystkie są mniejszymi i większymi kryteriami określania pewności IZW. Leczenie IZW opiera się na przedłużonej antybiotykoterapii (w większości przypadków od 4 do 6 tygodni) oraz operacji zastawkowej (według precyzyjnych wskazań).

Jednak w około 10% przypadków posiewy krwi pozostają ujemne. Są one znane jako ujemna kultura IE, która może być spowodowana antybiotykami pobranymi przed pobraniem próbki, bakteriami, których nie można hodować lub zjawiskami aseptycznymi. Następnie można zastosować PCR o szerokim zakresie, który polega na amplifikacji przez PCR, a następnie sekwencjonowaniu frakcji genu kodującego 16S RNA. Pozwala na identyfikację bakterii chorobotwórczej, ale nie daje informacji o nabytej oporności na antybiotyki.

Pojęcie metagenomiki klinicznej Metagenomika kliniczna jest definiowana jako zastosowanie wysokoprzepustowego sekwencjonowania (NGS), po którym następuje specyficzna analiza bioinformatyczna w celu uzyskania informacji klinicznych, tj. identyfikacji patogenów i przewidywania ich wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Metagenom próbki (tj. wszystkie genomy obecnych organizmów) praktycznie zawiera wszystkie informacje niezbędne do diagnozy bakteriologicznej: czym jest/są bakterie chorobotwórcze i na jakie antybiotyki jest/są wrażliwe. Koncepcja metagenomiki klinicznej rozwijała się równolegle z nowymi technologiami sekwencjonowania DNA wprowadzonymi w połowie 2000 roku i znacznie bardziej wydajnymi pod względem przepustowości niż metoda sekwencjonowania opisana przez Sangera. Chociaż koncepcja ta jest atrakcyjna, nadal istnieje wiele przeszkód w jej realizacji. Po pierwsze, próbki kliniczne z infekcji bakteryjnych zwykle zawierają wysokie stężenie leukocytów, których genom jest około 1000 razy większy niż genom bakterii. Zatem pierwszym ograniczającym krokiem dla metagenomiki klinicznej jest potrzeba uzyskania wystarczającej ilości bakteryjnego DNA, aby umożliwić przygotowanie wysokiej jakości bibliotek do sekwencjonowania, ale także zmniejszyć stężenie ludzkiego DNA, którego sekwencjonowanie jest niepotrzebne w tym kontekście. Metody są dostępne, ale konieczna jest ich ocena dla celów metagenomiki klinicznej. Po drugie, złożoność danych bioinformatycznych, którymi ma zarządzać mikrobiolog, wymaga jak najbardziej zautomatyzowanego wykorzystania danych wraz z przyjaznym dla użytkownika interfejsem, co nie ma obecnie miejsca, nawet jeśli rozwijane są platformy internetowe. Taksonomiczne przypisanie sekwencji, ich składanie, identyfikacja genów i mutacji chromosomowych związanych z opornością na antybiotyki oraz ustalenie powiązania między determinantą oporności a bakterią gospodarza to dodatkowe przeszkody we wdrażaniu metagenomiki klinicznej. Wreszcie, jeśli czas potrzebny do uzyskania wyników, które mogą być wykorzystane przez mikrobiologa, ma tendencję do skracania się, jest on teraz porównywalny z czasem hodowli, przy znacznie wyższych kosztach. Jednak utrzymująca się konkurencja między producentami sekwencerów powinna utrzymać ich spadek, tak jak miało to miejsce w ciągu ostatniej dekady.

Znaczenie zastosowania metagenomiki klinicznej w IE

Wykorzystanie metagenomiki klinicznej w kontekście IZW wydaje się zatem istotne z kilku powodów:

• Większość IE jest jednodrobnoustrojowa, co zgodnie z naszymi wstępnymi wynikami potwierdza dobre wyniki metagenomiki klinicznej.
• Hodowla próbek śródoperacyjnych wykonanych w kontekście IZW jest czasami ujemna z powodu wstępnego leczenia antybiotykami i/lub braku hodowli w rutynowych warunkach patogenu (np. Bartonella spp. lub Coxiella spp.), pozostawiając miejsce na poprawę.
• Leczenie IZW jest leczeniem długotrwałym, wymagającym dokładnej diagnostyki uwzględniającej wrażliwość patogenów na antybiotyki. Jeśli patogen nie zostanie stwierdzony w posiewie, pacjentowi należy podać antybiotyki o szerokim spektrum działania, co wiąże się z podwójnym ryzykiem niepowodzenia leczenia i toksyczności. Jednak metagenomika kliniczna może dostarczyć informacji na temat wrażliwości na antybiotyki, nawet w przypadku negatywnej hodowli.
• W większości przypadków diagnostyka mikrobiologiczna IZW nie jest diagnostyką doraźną, co jest zgodne z zastosowaniem metagenomiki klinicznej, dla której czas realizacji wynosi co najwyżej 48-72h.

Dlatego proponujemy ocenić skuteczność metagenomiki klinicznej w diagnostyce IZW.