Mikrobiota v moči a urotelu může být faktorem pro indukci rakoviny močového měchýře. Studie bude zkoumat tkáně moči a močového měchýře od egyptských mužských pacientů a kontrol pomocí technik úplného genomového sekvenování a 16S rRNA. Cílem je objasnit roli mikrobioty při rakovině močového měchýře. (Cancer bladder)

Cíle Cílem této výzkumné studie je charakterizovat urinární mikroflóru dospělých pacientů mužského pohlaví s rakovinou močového měchýře a korelovat s mikroflórou u zdravých dospělých mužů.

2-Metodika 2-1 Typ studie: Prospektivní případová kontrolní studie 2-2 Inkluze, kritéria vyloučení, proces náboru. [zařazení pacienti do studie budou požádáni, aby nabídli informovaný souhlas, Dr. Loay Mostafa a Dr. Mohamed Sahab z Urologického oddělení – TBRI budou zodpovědní za tuto položku].

Kritéria pro zařazení:

• Dospělí muži nad 18 let,
• Diagnostikován karcinom močového měchýře pomocí zobrazovací ultrasonografie a/nebo počítačové tomografie a cytologie moči.
• Potvrzený karcinom močového měchýře buď během diagnostické cystoskopie, předchozí patologie nebo patologického vyšetření bioptických vzorků.

Kritéria vyloučení:

• Předchozí radioterapie močového měchýře nebo sousedního orgánu.
• Předchozí intravezikální instilační imunoterapie bacilem Calmette-Guérin (BCG), případně intravezikální instilace chemoterapeutik.
• Předchozí neoadjuvantní chemoterapie. Proces náboru Pacienti splňující kritéria vyloučení a zařazení. 2-3 Velikost vzorku Třicet osm egyptských mužů ve věku ≥ 18 bude přijato na Urologické oddělení, TBRI podle výpočtu velikosti vzorku pomocí online softwaru (Sample Size Calculator). Od normálních jedinců bude odebráno deset vzorků moči.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html Velikost vzorku bude 16 pro nesvalovou invazivní rakovinu močového měchýře (NMIBC). To znamená, že je potřeba 16 nebo více měření/průzkumů k dosažení úrovně spolehlivosti 95 %. Velikost vzorku bude 11 pro svalovou invazivní rakovinu močového měchýře (MIBC). To znamená, že je potřeba 40 nebo více měření/průzkumů k dosažení úrovně spolehlivosti 95 %. Velikost vzorku bude 11 pro kontrolní skupinu. To znamená, že je potřeba 10 nebo více měření/průzkumů, aby byla hladina spolehlivosti 95 % A. Na Urologickém oddělení TBRI bude přijato 38 mužů. Podle výpočtu velikosti vzorku pomocí online softwaru (Sample Size Calculator). Bude odebráno 11 vzorků moči. Velikost vzorku bude 16 pro nesvalovou invazivní rakovinu močového měchýře (NMIBC). To znamená, že je potřeba 16 nebo více měření/průzkumů, aby byla hladina spolehlivosti 95%, že skutečná hodnota je v rozmezí ±17,53% naměřené/zjišťované hodnoty.

Velikost vzorku bude 11 pro svalovou invazivní rakovinu močového měchýře (MIBC). To znamená, že je potřeba 11 nebo více měření/průzkumů, aby byla hladina spolehlivosti 95 %, že skutečná hodnota je v rozmezí ±30,36 % naměřené/zjišťované hodnoty.

Velikost vzorku bude 11 pro kontrolní skupinu. To znamená, že je potřeba 11 nebo více měření/průzkumů, aby byla hladina spolehlivosti 95 %, že skutečná hodnota je v rozmezí ±30,36 % naměřené/zjišťované hodnoty.

normální jedinci. Tento vzorek představuje výzkum mikrobiomu u rakoviny močového měchýře.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Sběr vzorků

Rakovina močového měchýře:

Celkový počet studovaných vzorků: Studie prozkoumá mikrobiotu v moči a ve vzorcích tkání, takže každý pacient s rakovinou močového měchýře dá (2 vzorky). Kontrolní skupina podá vzorek moči (jeden vzorek). Nedávný výzkum ukázal, že mikroflóra je detekována v urotelu normálních jedinců a pacientů s rakovinou močového měchýře, tato mikroflóra by se lišila od močové (tekuté) mikroflóry.

Reference:

1-Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Mikrobiota související s rakovinou močového měchýře: zkoumání rozdílů ve vzorcích moči a tkání. Sci Rep. 2020 Jul 6;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2- Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilování mikrobioty močového měchýře u pacientů s rakovinou močového měchýře . Přední Microbiol. 7. února 2022;12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

Skupina I: Svalová invazivní rakovina močového měchýře, 16 pacientů, 16 pro tkáň močového měchýře a 16 pro vzorky moči. Celkem 32 vzorků. (Studie bude zkoumat mikrobiotu v moči a ve vzorcích tkání, takže každý pacient s rakovinou močového měchýře poskytne (2 vzorky). Kontrolní skupina podá vzorek moči (jeden vzorek). Nedávný výzkum ukázal, že mikroflóra je detekována v urotelu normálních jedinců a pacientů s rakovinou močového měchýře, tato mikroflóra se liší od močové (tekuté) mikroflóry. (Odkazy: ) Skupina II: Svalová invazivní rakovina močového měchýře, 11 pacientů. 22 vzorků 11 pro tkáň močového měchýře a 11 pro vzorky moči získané od stejných pacientů. Skupina III: 11 normálních dospělých: vzorky moči slouží jako kontrolní skupina studie.

Celkový počet účastníků je 38 jednotlivců.

Vzorky pro analýzu mikrobiomů:

Vzorky budou odebírány do čistých nepropustných nádob bez zbytků dezinfekčního prostředku nebo detergentu a s těsně přiléhajícími nepropustnými víčky a uchovávány v chladničce až do analýzy v mikrobiologické laboratoři TBRI.

Vzorky moči (50 ml) pro analýzu mikrobiomu budou odebrány během cystoskopického vyšetření. Vzorky budou až do zpracování skladovány při -80 °C.

Vzorky tkání a moči od pacientů s rakovinou močového měchýře: Standardním postupem diagnostické cystoskopie bude odebrán vzorek moči za zcela aseptických podmínek, u pacientů s nádorem močového měchýře bude provedena transuretrální resekce nádoru močového měchýře, bude vyšetřen vzorek tkáně 0,5x0,5 cm pro analýzu mikrobiomů. Vzorky budou až do zpracování skladovány při -80 °C. Histopatologickou diagnostiku hematoxylinem a eosinem provede odborný patolog pro stupeň a stadium nádoru podle WHO 22 a doporučení EAU 2023. Tento postup bude aplikován jak u nesvalově invazivního, tak u svalově invazivního uroteliálního karcinomu. Do velikosti vzorku budou zahrnuti pacienti, kteří podstoupí radikální cystektomii pro karcinom močového měchýře.

Vzorky pro patologické studie:

Vzorky tkání budou fixovány formalínem a vyšetřeny hematoxylinem a eosinem.

Klinické informace Urologové poskytnou adekvátní vzorky tkáně, což je malá část celého resekovaného nádoru nebo část vzorků po cystektomii. pro patologické vyhodnocení s poskytnutím užitečných klinických informací patologovi, aby mohl rozhodnout o nejlepším přístupu k manipulaci a zpracování chirurgických vzorků a vypracovat přesnou patologickou zprávu.

Urolog upřesní:

• Demografické údaje a klinická anamnéza pacienta, anamnéza infekce močových cest a pokud byla recidivující nebo sporadická, cytologie močového měchýře, pokud je přítomna, zda se jedná o první projev nádoru, a pokud ne, podrobnosti o předchozí léčbě.
• Cystoskopický vzhled sliznice močového měchýře a indikují počet, velikost, umístění nádoru/nádorů, morfologické rysy léze: papilární, solidní nebo ulcerózní.
• Stav zbývající sliznice, pokud byly provedeny další biopsie.

Tyto informace jsou nezbytné pro správné hodnocení urotelu a vyhledávání v mikrobiomu. Protože léčba může mít dopad na morfologii nádoru a na normálně vypadající urotel.

Hlášení vzorků rakoviny močového měchýře

• Patologické vyšetření Patolog určí přítomnost rakoviny močového měchýře a typ rakoviny močového měchýře vyšetřením buněk z biopsie tkáně močového měchýře. Různé typy histologických nádorů rakoviny močového měchýře budou hlášeny podle klasifikace nádorů močového měchýře z roku 2016 (Mazzucchelli et al. 2021), upravené v roce 2022.
• Mikrobiologické hodnocení: Metody mikrobiální identifikace z moči a tkáně

Odběr vzorků a podmínky kultivace klinických bakteriálních izolátů:

Detekce omezeného počtu mikroorganismů, především aerobních a rychle rostoucích bakterií.

Identifikace bakteriálních izolátů: Izoláty budou identifikovány kultivací na krvi, MacConkeyho agaru a sabaruds agaru, poté budou identifikovány provedením biochemických testů, oxidázového testu mannitolu, žlučového eskulinu a katalázového testu. Všechny izoláty budou identifikovány na úrovni druhu pomocí systému Vitek 2 compact.

2-5 Hodnocení biochemie a molekulární biologie: 16S Analýza metagenomického sekvenování Na všechny případy bude aplikováno úplné genomové sekvenování (WGS), metodika a kontrola kvality jsou podle genomického a metagenomického centra v dětské onkologické nemocnici 57357, které bude provádět WGS a 16S sekvenování na vzorcích moči a tkání.

1. Izolace DNA z moči a tkáně. Vzorky moči (50 ml) budou rozmraženy a centrifugovány při 7500 g, 4 °C po dobu 10 minut. Peleta bude použita pro extrakci DNA pomocí soupravy Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit, provedené podle protokolu výrobce. Aby se zabránilo kontaminaci životního prostředí, budou všechny izolace ze vzorků moči a z kontroly extrakce pouze reagenciemi prováděny v digestoři PCR. Izolované vzorky DNA budou umístěny při -20 °C až do PCR amplifikace. DNA bude kvantifikována pomocí DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Illumina 2013).
2. Kvantifikace knihoven KABA KAPA založené na PCR obsahují všechna činidla potřebná pro přesnou, spolehlivou a reprodukovatelnou kvantifikaci knihoven sekvenování nové generace (NGS) na bázi qPCR připravených pro sekvenování na platformách Illumina. Soupravy zahrnují KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formulovaný s různými pasivními referenčními barvivy pro různé qPCR přístroje), premix primerů pro kvantifikaci knihovny a předem naředěnou sadu standardů DNA.

Oblast V3-V4 genu 16S rRNA bude amplifikována fúzními primery, které obsahují adaptéry Illumina a indexační čárové kódy. Krok PCR přidává Index 1 (i7) a Index 2 (i5), sekvenování a běžné adaptéry (P5 a P7) potřebné pro generování a sekvenování klastrů. Pro zlepšení kontroly kvality analýzy NGS knihovny bude provedena vysoce citlivá elektroforéza DNA se systémem Bioanalyzer. 3- Příprava genové knihovny 16S rRNA a sekvenování MiSeq. PCR amplifikace 16S rDNA, sekvenování a analýzy budou provedeny pomocí NGS Illumina MiSeq zacílení oblasti V3V4 bakterií MiSeq Reagent Kit v3 (600-cyklus). Sekvenování amplikonu genu 16S rRNA (analýza 16S) se široce používá k analýze mikroflóry pomocí technologií sekvenování nové generace. Data analýzy 16S ze standardních sad primerů V3-V4 (V34) pro optimalizaci protokolu analýzy mikroflóry močového měchýře. 4- Bioinformatika a statistické analýzy. Anotovaný genom je dále analyzován pomocí bioinformatických kanálů, aby se získal pohled na biologii patogenu a potenciál způsobovat onemocnění. To zahrnuje:

- Kontrola kvality a zlepšování návrhu genomu odstraňováním chyb a vyplňováním mezer.

• Anotace konečného genomu, včetně identifikace a popisu funkcí genů a dalších znaků.
• Komparativní genomika, která zahrnuje porovnání nově sekvenovaného genomu s genomy příbuzných patogenů za účelem zjištění rozdílů a podobností.
• Funkční analýza: zahrnuje identifikaci funkcí anotovaných genů a pochopení drah a procesů, kterých se účastní. To může odhalit klíčové faktory virulence a pomoci porozumět mechanismu patogeneze patogenu.
• Fylogenetická analýza: To zahrnuje porovnání nově sekvenovaného genomu s genomem genomu
• souvisejících patogenů k určení evolučních vztahů a sledování šíření patogenů v různých populacích.
• Rozdíly v celkovém mikrobiálním složení mezi rakovinou močového měchýře a zdravými

• vzorky budou posuzovány. NGS není k dispozici v TBRI, sekvenování 16S a bioinformatika budou placeny v dětské nemocnici 57357 (vítáme, že sekvenování provedou na principu „placeno“).

  16S ribozomální RNA (rRNA) Sekvenační analýza

  1. Izolace DNA z moči a tkáně. Vzorky moči (50 ml) budou rozmraženy a centrifugovány při 7500 g, 4 °C po dobu 10 minut. Peleta bude použita pro extrakci DNA pomocí mikrobiomu DNA Purification Kit. Aby se zabránilo kontaminaci životního prostředí, budou všechny izolace ze vzorků moči a z kontroly extrakce pouze reagenciemi prováděny v digestoři PCR. Izolované vzorky DNA budou umístěny při -20 °C až do PCR amplifikace. DNA bude kvantifikována pomocí testovací soupravy (Illumina 2013).
  2. Kvantifikace knihoven KABA KAPA založené na PCR obsahují všechna činidla potřebná pro přesnou, spolehlivou a reprodukovatelnou kvantifikaci knihoven sekvenování nové generace (NGS) na bázi qPCR připravených pro sekvenování na platformách Illumina. Premix primerů pro kvantifikaci knihovny pro platformu a předem zředěná sada standardů DNA.

  Hypervariabilní oblasti 16S rRNA Oblast V1V2 a V3-V4 bude amplifikována fúzními primery, které obsahují adaptéry Illumina a indexační čárové kódy.

Pro zlepšení kontroly kvality analýzy NGS knihovny bude provedena vysoce citlivá elektroforéza DNA se systémem Bioanalyzer.

3- Příprava genové knihovny 16S rRNA a sekvenování MiSeq. PCR amplifikace 16S rRNA, sekvenování a analýzy budou provedeny pomocí NGS Illumina zacílením na oblast V1-V2 a V3-V4. Sekvenování amplikonu genu 16S rRNA (analýza 16S) bude použito k analýze mikroflóry pomocí technologií sekvenování nové generace. Data analýzy 16S ze standardních sad primerů V1-V2, V3-V4 pro optimalizaci protokolu analýzy mikroflóry močového měchýře.

4- Bioinformatika a statistické analýzy. Anotovaný genom je dále analyzován pomocí bioinformatických kanálů, aby se získal pohled na biologii patogenu a potenciál způsobovat onemocnění.