Mikrobiota w moczu i nabłonku dróg moczowych może być czynnikiem wywołującym raka pęcherza moczowego. W badaniu zostaną zbadane tkanki moczu i pęcherza moczowego pochodzących od egipskich mężczyzn oraz grupy kontrolnej, przy użyciu technik sekwencjonowania całego genomu i 16S rRNA. Celem jest wyjaśnienie roli mikroflory w raku pęcherza moczowego. (Cancer bladder)

Cele Celem tego badania jest scharakteryzowanie mikroflory układu moczowego dorosłych mężczyzn chorych na raka pęcherza moczowego i powiązanie jej z mikroflorą zdrowych dorosłych mężczyzn w grupie kontrolnej.

2-Metodologia 2-1 Typ badania: Prospektywne badanie kliniczno-kontrolne 2-2 Włączenie, kryteria wykluczenia, proces rekrutacji. [pacjenci włączeni do badania zostaną poproszeni o wyrażenie świadomej zgody, za tę pozycję odpowiedzialni będą dr Loay Mostafa i dr Mohamed Sahab z Oddziału Urologii – TBRI].

Kryteria przyjęcia:

• Dorośli mężczyźni powyżej 18 roku życia,
• Zdiagnozowano raka pęcherza moczowego za pomocą ultrasonografii obrazowej i/lub tomografii komputerowej oraz cytologii moczu.
• Potwierdzony rak pęcherza moczowego podczas cystoskopii diagnostycznej, wcześniejszej patologii lub badania patologicznego próbek biopsyjnych.

Kryteria wyłączenia:

• Wcześniejsza radioterapia pęcherza moczowego lub sąsiedniego narządu.
• Wcześniejsza immunoterapia dopęcherzowa poprzez wkroplenie Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lub dopęcherzowe wkroplenie chemioterapeutyków.
• Wcześniejsza chemioterapia neoadjuwantowa. Proces rekrutacji Pacjenci spełniający kryteria wykluczenia i włączenia. 2-3 Wielkość próby Trzydziestu ośmiu egipskich mężczyzn w wieku ≥ 18 lat zostanie zatrudnionych na oddziale urologii TBRI na podstawie obliczeń wielkości próby przy użyciu oprogramowania internetowego (Kalkulator wielkości próbki). Od zdrowych osób zostanie pobranych dziesięć próbek moczu.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html W przypadku nieinwazyjnego raka pęcherza moczowego (NMIBC) wielkość próbki wyniesie 16 osób. Oznacza to, że potrzeba 16 lub więcej pomiarów/ankiet, aby uzyskać poziom ufności wynoszący 95%. W przypadku inwazyjnego raka pęcherza moczowego (MIBC) wielkość próbki wyniesie 11 osób. Oznacza to, że potrzeba 40 lub więcej pomiarów/ankiet, aby uzyskać poziom ufności wynoszący 95%. Wielkość próby dla grupy kontrolnej będzie wynosić 11. Oznacza to, że potrzeba 10 lub więcej pomiarów/ankiet, aby uzyskać poziom ufności wynoszący 95% A. Na Oddziale Urologii TBRI zostanie zatrudnionych 38 mężczyzn. Zgodnie z obliczeniami wielkości próbki przy użyciu oprogramowania online (Kalkulator wielkości próbki). Zostanie pobranych jedenaście próbek moczu z wielkości próbki wynoszącej 16 w przypadku nieinwazyjnego raka pęcherza moczowego (NMIBC). Oznacza to, że potrzeba 16 lub więcej pomiarów/ankiet, aby uzyskać poziom ufności wynoszący 95%, że rzeczywista wartość mieści się w granicach ±17,53% zmierzonej/badanej wartości.

W przypadku inwazyjnego raka pęcherza moczowego (MIBC) wielkość próbki wyniesie 11 osób. Oznacza to, że potrzeba 11 lub więcej pomiarów/ankiet, aby uzyskać poziom ufności wynoszący 95%, że rzeczywista wartość mieści się w granicach ±30,36% zmierzonej/badanej wartości.

Wielkość próby dla grupy kontrolnej będzie wynosić 11. Oznacza to, że potrzeba 11 lub więcej pomiarów/ankiet, aby uzyskać poziom ufności wynoszący 95%, że rzeczywista wartość mieści się w granicach ±30,36% zmierzonej/badanej wartości.

normalne osoby. Ta próbka reprezentuje badania nad mikrobiomem w raku pęcherza moczowego.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Pobieranie próbek

Rak pęcherza:

Całkowita liczba badanych próbek: W badaniu zostanie zbadana mikrobiota w moczu i próbkach tkanek, więc każdy pacjent z rakiem pęcherza moczowego odda (2 próbki). Grupa kontrolna odda próbkę moczu (jedna próbka). Niedawne badania wykazały, że mikroflorę wykrywa się w nabłonku dróg moczowych u zdrowych osób i pacjentów z rakiem pęcherza moczowego. Mikroflora ta różni się od mikroflory moczu (płynnego).

Bibliografia:

1-Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Mikrobiota związana z rakiem pęcherza moczowego: badanie różnic w próbkach moczu i tkanek. Sci Rep. 2020 6 lipca;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2- Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilowanie mikrobioty pęcherza u pacjentów z rakiem pęcherza moczowego . Przedni mikrobiolog. 7 lutego 2022 r.;12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

Grupa I: Nieinwazyjny rak pęcherza moczowego, 16 pacjentów, 16 w przypadku tkanki pęcherza i 16 w przypadku próbek moczu. Łącznie 32 próbki. (W badaniu zostanie zbadana mikrobiota w moczu i próbkach tkanek, więc każdy pacjent z rakiem pęcherza moczowego odda (2 próbki). Grupa kontrolna odda próbkę moczu (jedna próbka). Niedawne badania wykazały, że mikroflorę wykrywa się w nabłonku dróg moczowych u zdrowych osób i pacjentów z rakiem pęcherza moczowego. Ta mikroflora różni się od mikroflory (płynnej) moczu. (Źródło: ) Grupa II: Rak pęcherza moczowego naciekający mięśnie, 11 pacjentów. 22 próbki, 11 na tkankę pęcherza moczowego i 11 na próbki moczu pobrane od tych samych pacjentów. Grupa III: 11 zdrowych dorosłych: próbki moczu stanowią grupę kontrolną badania.

Łączna liczba uczestników to 38 osób.

Próbki do analizy mikrobiomu:

Próbki będą pobierane do czystych, szczelnych pojemników, bez pozostałości środków dezynfekcyjnych i detergentów, z szczelnie przylegającymi, szczelnymi pokrywkami i przechowywane w lodówce do czasu analizy w laboratorium mikrobiologicznym TBRI.

Podczas badania cystoskopowego zostaną pobrane próbki moczu (50 ml) do analizy mikrobiomu. Próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C do momentu przetworzenia.

Próbki tkanek i moczu od pacjentów chorych na raka pęcherza moczowego: W ramach standardowej procedury cystoskopii diagnostycznej próbka moczu zostanie pobrana w warunkach całkowitej aseptyki, u pacjentów z guzem pęcherza moczowego zostanie poddana przezcewkowej resekcji guza pęcherza moczowego, zostanie zbadana próbka tkanki o wymiarach 0,5x0,5 cm do analizy mikrobiomu. Próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C do momentu przetworzenia. Diagnoza histopatologiczna z użyciem barwienia hematoksyliną i eozyną zostanie przeprowadzona przez doświadczonego patologa w celu ustalenia stopnia i stadium nowotworu zgodnie z wytycznymi WHO 22 i EAU 2023. Procedura ta będzie stosowana zarówno w przypadku raka nabłonkowego nienaciekającego mięśnie, jak i raka naciekającego mięśnie. Pacjenci, którzy zostaną poddani radykalnej cystektomii z powodu raka pęcherza moczowego, zostaną uwzględnieni w próbie.

Próbki do badań patologicznych:

Próbki tkanek zostaną utrwalone formaliną i zbadane barwieniem hematoksyliną i eozyną.

Informacje kliniczne Urolodzy dostarczą odpowiednie próbki tkanek, czyli niewielką część całego wyciętego guza lub część wycinka po cystektomii. do oceny patologicznej z przekazaniem patologowi przydatnych informacji klinicznych w celu podjęcia decyzji o najlepszym podejściu do postępowania z próbkami chirurgicznymi i ich przetwarzania oraz sporządzenia dokładnego raportu patologicznego.

Urolog określi:

• Dane demograficzne i historia kliniczna pacjenta, historia infekcji dróg moczowych i jeśli była nawracająca lub sporadyczna, cytologia pęcherza moczowego, jeśli jest obecna, czy jest to pierwsza prezentacja guza, a jeśli nie, szczegóły poprzedniego leczenia.
• Cystoskopowy wygląd błony śluzowej pęcherza moczowego i wskazuje liczbę, wielkość, lokalizację guza/guzów, cechy morfologiczne zmiany: brodawkowata, lita lub wrzodziejąca.
• Stan pozostałej błony śluzowej w przypadku wykonania dalszych biopsji.

Informacje te są niezbędne do prawidłowej oceny nabłonka dróg moczowych i poszukiwania mikrobiomu. Ponieważ leczenie może mieć wpływ na morfologię guza i normalny wygląd nabłonka dróg moczowych.

Zgłaszanie próbek raka pęcherza moczowego

• Ocena patologiczna Patolog zdiagnozuje, czy występuje rak pęcherza moczowego i jego rodzaj, badając komórki z biopsji tkanki pęcherza moczowego. Różne typy nowotworów histologicznych raka pęcherza moczowego zostaną opisane zgodnie z klasyfikacją WHO dotyczącą nowotworów pęcherza moczowego z 2016 r. (Mazzucchelli i wsp. 2021), zmodyfikowaną w 2022 r.
• Ocena mikrobiologiczna: Metody identyfikacji drobnoustrojów z moczu i tkanek

Pobieranie próbek i warunki hodowli klinicznych izolatów bakteryjnych:

Wykrywanie ograniczonej liczby mikroorganizmów, głównie bakterii tlenowych i szybko rosnących.

Identyfikacja izolatów bakterii: Izolaty zostaną zidentyfikowane poprzez hodowlę na krwi, agarze MacConkeya i agarze Sabarudsa, a następnie zostaną zidentyfikowane poprzez wykonanie testów biochemicznych, testu oksydazowego, mannitolu, eskuliny żółciowej i testu katalazy. Wszystkie izolaty zostaną zidentyfikowane na poziomie gatunku przy użyciu systemu kompaktowego Vitek 2.

2-5 Ocena biochemii i biologii molekularnej: 16S Analiza sekwencjonowania metagenomicznego We wszystkich przypadkach zastosowane zostanie sekwencjonowanie całego genomu (WGS), metodologia i kontrola jakości są zgodne z centrum genomiki i metagenomiki w dziecięcym szpitalu onkologicznym 57357, które zamierza wykonać Sekwencjonowanie WGS i 16S na próbkach moczu i tkanek.

1. Izolacja DNA z moczu i tkanek. Próbki moczu (50 ml) zostaną rozmrożone i odwirowane przy 7500 g, 4°C przez 10 minut. Osad zostanie użyty do ekstrakcji DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania mikrobiomu DNA Invitrogen™ PureLink™, przeprowadzonej zgodnie z protokołem producenta. Aby uniknąć skażenia środowiska, wszystkie izolacje z próbek moczu i kontroli ekstrakcji samego odczynnika będą przeprowadzane w komorze PCR. Wyizolowane próbki DNA zostaną umieszczone w temperaturze -20°C do czasu amplifikacji PCR. DNA będzie oznaczane ilościowo przy użyciu zestawu DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Illumina 2013).
2. Zestawy do kwantyfikacji bibliotek KABA KAPA oparte na PCR zawierają wszystkie odczynniki potrzebne do dokładnego, niezawodnego i powtarzalnego oznaczania ilościowego opartego na qPCR bibliotek sekwencjonowania nowej generacji (NGS) przygotowanych do sekwencjonowania na platformach Illumina. Zestawy obejmują KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (skomponowany z różnych pasywnych barwników referencyjnych dla różnych instrumentów qPCR), premiks starterów do kwantyfikacji specyficznej dla biblioteki oraz wstępnie rozcieńczony zestaw standardów DNA.

Region V3-V4 genu 16S rRNA będzie amplifikowany starterami fuzyjnymi, które zawierają adaptery Illumina i indeksujące kody kreskowe. Etap PCR dodaje Indeks 1 (i7) i Indeks 2 (i5), sekwencjonowanie i wspólne adaptery (P5 i P7) wymagane do generowania klastrów i sekwencjonowania. W celu usprawnienia analizy kontroli jakości biblioteki NGS zostanie przeprowadzona elektroforeza DNA o wysokiej czułości przy użyciu systemu Bioanalyzer. Przygotowanie biblioteki genowej 3-16S rRNA i sekwencjonowanie MiSeq. Amplifikacja PCR 16S rDNA, sekwencjonowanie i analizy zostaną przeprowadzone za pomocą NGS Illumina MiSeq ukierunkowanego na region V3V4 bakterii MiSeq Reagent Kit v3 (600 cykli). Sekwencjonowanie amplikonu genu 16S rRNA (analiza 16S) jest szeroko stosowane do analizy mikroflory za pomocą technologii sekwencjonowania nowej generacji. Dane analizy 16S ze standardowych zestawów starterów V3-V4 (V34) w celu optymalizacji protokołu analizy mikroflory pęcherza moczowego. 4- Bioinformatyka i analizy statystyczne. Genom z adnotacjami jest dalej analizowany za pomocą rurociągów bioinformatycznych, aby uzyskać wgląd w biologię patogenu i potencjał wywoływania choroby. Obejmuje:

- Kontrola jakości i doskonalenie projektu genomu poprzez usuwanie błędów i uzupełnianie luk.

• Adnotacja ostatecznego genomu, obejmująca identyfikację i opis funkcji genów i innych cech.
• Genomika porównawcza, która polega na porównaniu nowo zsekwencjonowanego genomu z genomem pokrewnych patogenów w celu zidentyfikowania różnic i podobieństw.
• Analiza funkcjonalna: obejmuje identyfikację funkcji opisanych genów oraz zrozumienie ścieżek i procesów, w których uczestniczą. Może to ujawnić kluczowe czynniki zjadliwości i pomóc w zrozumieniu mechanizmu patogenezy patogenu.
• Analiza filogenetyczna: polega na porównaniu nowo zsekwencjonowanego genomu z genomem
• pokrewnych patogenów w celu określenia powiązań ewolucyjnych i śledzenia rozprzestrzeniania się patogenów w różnych populacjach.
• Różnice w ogólnym składzie mikrobiologicznym między rakiem pęcherza moczowego a zdrowym

• próbki zostaną poddane ocenie. NGS nie jest dostępny w TBRI, sekwencjonowanie 16S i bioinformatyka będą wykonywane odpłatnie w Szpitalu Dziecięcym 57357 (sekwencjonowanie jest mile widziane na zasadzie „płatnej”).

  Analiza sekwencjonowania 16S rybosomalnego RNA (rRNA).

  1. Izolacja DNA z moczu i tkanek. Próbki moczu (50 ml) zostaną rozmrożone i odwirowane przy 7500 g, 4°C przez 10 minut. Osad zostanie użyty do ekstrakcji DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA mikrobiomu. Aby uniknąć skażenia środowiska, wszystkie izolacje z próbek moczu i kontroli ekstrakcji samego odczynnika będą przeprowadzane w komorze PCR. Wyizolowane próbki DNA zostaną umieszczone w temperaturze -20°C do czasu amplifikacji PCR. Ilość DNA zostanie określona przy użyciu zestawu testowego (Illumina 2013).
  2. Zestawy do kwantyfikacji bibliotek KABA KAPA oparte na PCR zawierają wszystkie odczynniki potrzebne do dokładnego, niezawodnego i powtarzalnego oznaczania ilościowego opartego na qPCR bibliotek sekwencjonowania nowej generacji (NGS) przygotowanych do sekwencjonowania na platformach Illumina. Specyficzna dla platformy premiks starterów do ilościowego oznaczania biblioteki i wstępnie rozcieńczony zestaw standardów DNA.

  Regiony hiperzmienne 16S rRNA V1V2 i V3-V4 zostaną amplifikowane starterami fuzyjnymi, które zawierają adaptery Illumina i indeksujące kody kreskowe.

W celu usprawnienia analizy kontroli jakości biblioteki NGS zostanie przeprowadzona elektroforeza DNA o wysokiej czułości przy użyciu systemu Bioanalyzer.

Przygotowanie biblioteki genowej 3-16S rRNA i sekwencjonowanie MiSeq. Amplifikacja PCR 16S rRNA, sekwencjonowanie i analizy zostaną przeprowadzone przez NGS Illumina, ukierunkowując się na regiony V1-V2 i V3-V4. Sekwencjonowanie amplikonu genu 16S rRNA (analiza 16S) zostanie wykorzystane do analizy mikroflory za pomocą technologii sekwencjonowania nowej generacji. Dane analizy 16S ze standardowych zestawów starterów V1-V2, V3-V4 w celu optymalizacji protokołu analizy mikroflory pęcherza moczowego.

4- Bioinformatyka i analizy statystyczne. Genom z adnotacjami jest dalej analizowany za pomocą rurociągów bioinformatycznych, aby uzyskać wgląd w biologię patogenu i potencjał wywoływania choroby.