Genetická krajina u žen s metastatickým karcinomem vaječníků před a během léčby inhibitory PARP

Analýza periferní krve

Po odebrání bude na vzorcích periferní krve provedena následující analýza:

1. morfologické hodnocení s možnou identifikací dysplastických změn zahrnujících jednu nebo více hematopoetických linií, které naznačují nebo nenaznačují myelodysplastický syndrom nebo akutní leukémie;
2. cytofluorimetrická analýza fenotypu mononukleárních buněk k identifikaci možných abnormalit v diferenciační dráze a přítomnosti blastů.

Imunitní fenotypizace bude provedena pomocí 10barevné multiparametrické FACS analýzy (Navios, Beckman Coulter). Zrání myeloidních buněk a přítomnost progenitorů/blastů bude hodnocena ve vzorcích krve s následujícími markery:

• CD66b, CD11b, CD16, CD38, CD34, CD13, CD14, CD33, CD45, HLA-DR
• CD34, CD117, CD45, CD10, CD19, CD13, CD33, CD64, CD36, CD71 Zbytek analýz bude proveden na rozmražených mononukleárních buňkách. Pro každé barvení bude použit marker buněčné životaschopnosti (Live/Dead, Thermo Fisher Scientific). Parametry budou vybrány na základě předchozích výsledků získaných z analýzy genomu a fenotypu.

Dopad léčby na různé buněčné populace bude měřen porovnáním pacientů.

Analýza kostní dřeně

Materiál kostní dřeně bude odebrán aspirátem kostní dřeně a biopsií kostní dřeně a bude provedena následující analýza:

• Odsát kostní dřeně:

  1. morfologické hodnocení s možnou identifikací dysplastických změn zahrnujících jednu nebo více hematopoetických linií, které naznačují nebo nenaznačují myelodysplastický syndrom nebo akutní leukémie;
  2. cytofluorimetrická analýza fenotypu mononukleárních buněk k identifikaci možných abnormalit v diferenciační dráze a přítomnosti blastů;

  3. cytogenetickou a FISH analýzu k identifikaci možné přítomnosti chromozomálních abnormalit vyvolaných předchozí nebo probíhající léčbou.

     Vzorky heparinové kostní dřeně budou odeslány do hematologické laboratoře a budou čerstvě zpracovány podle standardních diagnostických postupů.

     Pro cytogenetickou analýzu bude alespoň 10x106 buněk kultivováno po dobu 24/48 hodin a budou zpracovány podle standardního protokolu pro analýzu karyotypu. Metafáze budou obarveny páskováním QFQ a analyzovány pomocí Cytovysion Software (Leica). Bude analyzováno a hlášeno nejméně 20 metafází.

     Pro analýzu FISH bude zpracováno alespoň 500 ul vzorku kostní dřeně podle standardního protokolu. Pro analýzu FISH bude použit panel sond běžně používaných v hematologické laboratoři pro myelodysplastické pacienty:

     EGR1/D5S630 pro monosomii/deleci 5q Vysis Probe D7S486/CEN7 pro monosomii7/deleci 7q Vysis Probe MECOM/EVI1 pro inv(3)/t(3;3) Cytocell Probe D20S108 pro deleci 20q Vysis Probe Probey8 Každý sonda bude vyhodnocena dne 200 jader a budou hlášeny s abnormalitami, pokud jsou nad naší vnitřní hranicí.

• Řezy zalité v parafínu z biopsie kostní dřeně:

  1. morfologické hodnocení;
  2. imunohistochemie.

Genetická analýza

V průběhu studie budou provedeny tyto typy genetické analýzy:

1. analýza zárodečných variant. K identifikaci zárodečných genetických variant, které mohou u pacientek s rakovinou vaječníků predisponovat k rozvoji t-MN, bude použit vlastní personalizovaný genetický panel Myelo Panel. Panel se zaměří na geny predisponující k rakovině, včetně těch, které jsou nejčastěji spojovány s rizikem rozvoje hematologických nádorů, na ovladače AML, použitelné geny a farmakogenomické SNP;

2. analýza CHIP. Pro detekci přítomnosti CHIP u zařazených pacientů a sledování vývoje klonů CHIP po léčbě inhibitorem PARP bude použita vysoce citlivá sekvenační technologie NGS: sekvenování Unique Molecular Barcoding (UMI). Protokol sekvenování UMI, spojený s obohacením vlastního cíle, umožňuje detekovat mutace s frekvencí až 0,1 %. Bude použit personalizovaný genetický panel obsahující 80 nejčastěji mutovaných genů v CHIP.

   ABL1 BRCC3 ETV6 HIST1H1C MPL PIK3CA SETD2 STAT3 ASXL1 CALR EZH2 IDH1 MYD88 PPM1D SETDB1 SUZ12 ASXL2 KARTA11 TENT5C (FAM46C) IDH2 NF1 PRDM1 CSF7 NOT1 FETZFX ABL PTPN11 SF3B1 TET2 ATRX CBLB FLT1 JAK2 NOTCH2 RAD21 SH2B3 TNFAIP3 AXL CEBPA FLT3 JAK3 NOTCH3 RHEB SMAD4 TNFRSF14 BCOR CREBBP FOXP1 KDM6A NPM1 RICTOR RICIT3 BUX1AS GMC12TP1A CEBPA SMC3 U2AF1 BIRC3 DNMT3A GNAS KMT2D (MLL2) PAX5 RUNX1 SRSF2 WT1 BRAF EP300 GNB1 KRAS PHF6 SETBP1 STAG2 ZRSR2

3. analýza mutací spojených s myeloidními malignitami. Pro identifikaci genomové krajiny vyvinutého t-MN bude mutační stav 69 genů potenciálně zapojených do rozvoje myeloidního onemocnění hodnocen pomocí komerčně dostupného diagnostického panelu: Oncomine Myeloid Research Assay (Thermo Fisher Scientific, viz příloha 5). Paralelně budou získané výsledky porovnány s vlastním genovým panelem vyvinutým na zakázku, Myelo Panel, který také zahrnuje geny nejčastěji spojované s rizikem rozvoje hematologických malignit, ovladače AML, použitelné geny a farmakogenomické SNP.

   Časová osa analýzy U každého zařazeného pacienta bude provedena podrobná analýza níže. Před léčbou inhibitory PARP (jako první linie a jako udržovací léčba)

   Bukální buňky:

   • vlastní panel myeloidních genů (Myelo-Panel) k identifikaci zárodečných mutací predisponujících k rozvoji rakoviny (Thermo Fisher Scientific)

   Buňky kostní dřeně (volitelné, pro srovnání, pouze u omezeného počtu pacientů):

   - morfologický rozbor

   • imunofenotyp
   • cytogenetika/FISH
   • analýza CHIP pomocí vlastního genového panelu a vysoce citlivého NGS

   Periferní krvinky:

   • analýza CHIP pomocí vlastního genového panelu a vysoce citlivého NGS

   Biopsie kostní dřeně (volitelné, pro srovnání, pouze u omezeného počtu pacientů):

   - histologie

   - imunohistochemie

   Každých 6 měsíců během léčby inhibitory PARP

   Periferní krvinky:

   - analýza CHIP pomocí vlastního genového panelu a vysoce citlivého NGS

   Objevení se abnormalit krevního obrazu a/nebo hematologických novotvarů Během udržovací léčby inhibitorem PARP budou pacienti měsíčně sledováni klinickým vyšetřením a vyšetřením krevního obrazu. V případě výskytu abnormalit krevního obrazu (CTCAE stupeň ≥ 2 a/nebo krevní destičky < 100 000/mmc), zahrnující alespoň jednu hematopoetickou subpopulaci, léčivo bude pozastaveno a počet krvinek se hodnotí každé 2 týdny. V případě zotavení bude lék znovu zaveden. V případě stability nebo dalšího zhoršení bude vyšetření kostní dřeně a periferní krve (analýza podrobně popsána níže) provedeno minimálně po 4-8 týdnech od vysazení inhibitoru PARP, pokud není zhoršení krevního obrazu tak rychlé, že vyžaduje kostní dřeň hodnocení předtím.

   Při výskytu abnormalit krevního obrazu se provede následující analýza:

   Buňky kostní dřeně:

   - morfologický rozbor

   - imunofenotyp

   - cytogenetika/FISH

   • analýza mutací jak Oncomine Myeloid Research Panel, tak naším vlastním Myelo-Panelem (Thermo Fisher Scientific)
   • analýza CHIP pomocí vlastního genového panelu a vysoce citlivého NGS

   Biopsie kostní dřeně:

   • histologie
   • imunohistochemie