Genetische Landschaft bei Frauen mit metastasiertem Eierstockkrebs vor und während der Behandlung mit PARP-Inhibitoren

Analyse des peripheren Blutes

Nach dem Entzug wird die folgende Analyse der peripheren Blutproben durchgeführt:

1. morphologische Bewertung mit möglicher Identifizierung dysplastischer Veränderungen, die eine oder mehrere hämatopoetische Abstammungslinien betreffen, die auf ein myelodysplastisches Syndrom oder akute Leukämien hinweisen oder nicht;
2. Zytofluorimetrische Analyse des Phänotyps mononukleärer Zellen, um mögliche Anomalien im Differenzierungsweg und das Vorhandensein von Blasten zu identifizieren.

Die Immunphänotypisierung wird durch multiparametrische FACS-Analyse mit 10 Farben (Navios, Beckman Coulter) durchgeführt. Die Reifung myeloischer Zellen und das Vorhandensein von Vorläufern/Blasten werden in Blutproben anhand der folgenden Marker beurteilt:

• CD66b, CD11b, CD16, CD38, CD34, CD13, CD14, CD33, CD45, HLA-DR
• CD34, CD117, CD45, CD10, CD19, CD13, CD33, CD64, CD36, CD71 Der Rest der Analysen wird an aufgetauten mononukleären Zellen durchgeführt. Für jede Färbung wird ein Marker für die Lebensfähigkeit der Zellen verwendet (Live/Dead, Thermo Fisher Scientific). Die Parameter werden auf der Grundlage früherer Ergebnisse aus der Genom- und Phänotypanalyse ausgewählt.

Die Auswirkungen der Behandlung auf verschiedene Zellpopulationen werden durch den Vergleich von Patienten gemessen.

Analyse am Knochenmark

Knochenmarkmaterial wird durch Knochenmarkaspiration und Knochenmarkbiopsie entnommen und die folgende Analyse durchgeführt:

• Knochenmarkspunktion:

  1. morphologische Bewertung mit möglicher Identifizierung dysplastischer Veränderungen, die eine oder mehrere hämatopoetische Abstammungslinien betreffen, die auf ein myelodysplastisches Syndrom oder akute Leukämien hinweisen oder nicht;
  2. zytofluorimetrische Analyse des Phänotyps mononukleärer Zellen, um mögliche Anomalien im Differenzierungsweg und das Vorhandensein von Blasten zu identifizieren;

  3. Zytogenetische und FISH-Analyse, um das mögliche Vorhandensein von Chromosomenanomalien zu identifizieren, die durch die vorherige oder laufende Behandlung verursacht wurden.

     Heparin-Knochenmarksproben werden an das Hämatologielabor geschickt und gemäß den Standarddiagnoseverfahren frisch verarbeitet.

     Für die zytogenetische Analyse werden mindestens 10x106 Zellen 24/48 Stunden lang kultiviert und nach einem Standardprotokoll für die Karyotypanalyse verarbeitet. Die Metaphasen werden mit QFQ-Banding gefärbt und mit Cytovysion Software (Leica) analysiert. Mindestens 20 Metaphasen werden analysiert und gemeldet.

     Für die FISH-Analyse werden mindestens 500 µl Knochenmarksprobe nach einem Standardprotokoll verarbeitet. Für die FISH-Analyse werden die im Hämatologielabor routinemäßig für myelodysplastische Patienten verwendeten Sonden verwendet:

     EGR1/D5S630 für Monosomie/Deletion 5q Vysis-Sonde D7S486/CEN7 für Monosomie7/Deletion 7q Vysis-Sonde MECOM/EVI1 für inv(3)/t(3;3) Zytozellsonde D20S108 für Deletion 20q Vysis-Sonde CEN8 für Trisomie 8 Vysis-Sonde Jeweils Sonde wird auf 200 ausgewertet Kerne und werden mit Anomalien gemeldet, wenn sie über unserem internen Grenzwert liegen.

• In Paraffin eingebettete Schnitte aus der Knochenmarksbiopsie:

  1. morphologische Bewertung;
  2. Immunhistochemie.

Genetische Analyse

Im Verlauf der Studie werden folgende Arten genetischer Analysen durchgeführt:

1. Analyse von Keimbahnvarianten. Um genetische Keimbahnvarianten zu identifizieren, die Eierstockkrebspatientinnen für die Entwicklung von t-MN prädisponieren könnten, wird ein eigens entwickeltes personalisiertes genetisches Panel, das Myelo Panel, verwendet. Das Gremium wird sich auf krebsprädisponierende Gene konzentrieren, einschließlich derjenigen, die am häufigsten mit dem Risiko der Entwicklung von hämatologischen Tumoren, AML-Treibern, umsetzbaren Genen und Pharmakogenomik-SNPs in Verbindung gebracht werden.

2. Analyse von CHIP. Um das Vorhandensein von CHIP bei den aufgenommenen Patienten nachzuweisen und die Entwicklung der CHIP-Klone nach der Behandlung mit PARP-Inhibitor zu überwachen, wird eine hochempfindliche NGS-Sequenzierungstechnologie eingesetzt: Unique Molecular Barcoding (UMI)-Sequenzierung. Das UMI-Sequenzierungsprotokoll ermöglicht in Verbindung mit der benutzerdefinierten Zielanreicherung die Erkennung von Mutationen mit einer Häufigkeit von nur 0,1 %. Es wird ein personalisiertes genetisches Panel verwendet, das die 80 am häufigsten mutierten Gene in CHIP enthält.

   ABL1 BRCC3 ETV6 HIST1H1C MPL PIK3CA SETD2 STAT3 ASXL1 CALR EZH2 IDH1 MYD88 PPM1D SETDB1 SUZ12 ASXL2 CARD11 TENT5C (FAM46C) IDH2 NF1 PRDM1 SF1 TET1 ATM CBL FBXW7 IKZF1 NOTCH1 PTPN11 SF3B1 TET2 ATRX CBLB FLT1 JAK2 NOTCH2 RAD21 SH2B3 TNFAIP3 AXL CEBPA FLT3 JAK3 NOTCH3 RHEB SMAD4 TNFRSF14 BCOR CREBBP FOXP1 KDM6A NPM1 RICTOR SMC1A TP53 BCORL1 CUX1 GATA2 KIT NRAS RIT1 SMC3 U2AF1 BIRC3 DNMT3A GNAS KMT2D (MLL2) PAX5 RUNX1 SRSF2 WT1 BRAF EP300 GNB1 KRAS PHF6 SETBP1 STAG2 ZRSR2

3. Analyse von Mutationen im Zusammenhang mit myeloischen Malignomen. Um die genomische Landschaft des entwickelten t-MN zu identifizieren, wird der Mutationsstatus von 69 Genen, die möglicherweise an der Entwicklung einer myeloischen Erkrankung beteiligt sind, mithilfe eines kommerziell erhältlichen Diagnosepanels bewertet: Oncomine Myeloid Research Assay (Thermo Fisher Scientific, siehe Anhang 5). Parallel dazu werden die erzielten Ergebnisse mit dem eigens entwickelten, maßgeschneiderten Gen-Panel, dem Myelo-Panel, verglichen, das auch Gene umfasst, die am häufigsten mit dem Risiko für die Entwicklung hämatologischer Malignome assoziiert sind, AML-Treiber, umsetzbare Gene und pharmakogenomische SNPs.

   Analysezeitplan Für jeden registrierten Patienten wird die folgende detaillierte Analyse durchgeführt. Vor der Behandlung mit PARP-Hemmern (als Erstlinien- und Erhaltungstherapie)

   Bukkale Zellen:

   • Benutzerdefiniertes myeloisches Gen-Panel (Myelo-Panel) zur Identifizierung von Keimbahnmutationen, die für die Krebsentstehung prädisponieren (Thermo Fisher Scientific)

   Knochenmarkszellen (optional, zum Vergleich, nur bei einer begrenzten Anzahl von Patienten):

   - morphologische Analyse

   • Immunphänotyp
   • Zytogenetik/FISH
   • Analyse von CHIP durch benutzerdefiniertes Genpanel und hochempfindliches NGS

   Periphere Blutzellen:

   • Analyse von CHIP durch benutzerdefiniertes Genpanel und hochempfindliches NGS

   Knochenmarkbiopsie (optional, zum Vergleich, nur bei einer begrenzten Anzahl von Patienten):

   - Histologie

   - Immunhistochemie

   Alle 6 Monate während der PARP-Inhibitor-Behandlung

   Periphere Blutzellen:

   - CHIP-Analyse durch benutzerdefiniertes Genpanel und hochempfindliches NGS

   Auftreten von Blutbildanomalien und/oder hämatologischen Neoplasien Während der PARP-Inhibitor-Erhaltungstherapie werden die Patienten monatlich durch klinische Untersuchungen und Blutbilduntersuchungen überwacht. Bei Auftreten von Blutbildanomalien (CTCAE-Grad ≥ 2 und/oder Blutplättchen <100.000/mmc), Wenn mindestens eine hämatopoetische Subpopulation betroffen ist, wird das Medikament abgesetzt und das Blutbild alle zwei Wochen ausgewertet. Im Falle einer Genesung wird das Medikament wieder eingeführt. Im Falle einer Stabilität oder einer weiteren Verschlechterung werden Knochenmarks- und periphere Blutuntersuchungen (Analyse unten detailliert) mindestens 4–8 Wochen nach der Unterbrechung des PARP-Inhibitors durchgeführt, es sei denn, die Verschlechterung des Blutbildes erfolgt so schnell, dass eine Knochenmarkuntersuchung erforderlich ist Bewertung vorher.

   Bei Auftreten von Auffälligkeiten im Blutbild wird folgende Analyse durchgeführt:

   Knochenmarkszellen:

   - morphologische Analyse

   - Immunphänotyp

   - Zytogenetik/FISH

   • Analyse von Mutationen sowohl durch das Oncomine Myeloid Research Panel als auch durch unser maßgeschneidertes Myelo-Panel (Thermo Fisher Scientific)
   • Analyse von CHIP durch benutzerdefiniertes Genpanel und hochempfindliches NGS

   Knochenmarkbiopsie:

   • Histologie
   • Immunhistochemie