Nepřetržité monitorování steroidů v intersticiální tekutině s nositelnými a nanočásticovými biosenzory pro zlepšení léčby poruch nadledvin

Pro sledování dynamiky steroidů v rutinním prostředí je výběr tělesné tekutiny kritický, protože diktuje snadnost a frekvenci sběru, který je tolerován jednotlivci. Zatímco zlatý standard je založen na krevním testu, lze přistupovat několik tělních tekutin minimálně invazivní, včetně moči, potu, dechu, slin a intersticiální tekutiny. Slibnější pro monitorování steroidů je intersticiální tekutina, protože úzce odráží složení krevní plazmy v důsledku kontinuálního přenosu hmoty. Ve skutečnosti to bylo prokázáno teprve minulý rok s použitím subkutánně implantovaného mikroalyzovaného katétru, který shromažďoval intersticiální tekutinu s infuzním čerpadlem. Nosilo se kolem pasu, vzorky byly odebrány po dobu 24 hodin u 214 dobrovolníků a analyzovány offline kapalinovou chromatografií-hmotnostní spektrometrií/hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Tímto způsobem byl kortizol přesně sledován a sledoval podobnou dynamiku v tkáni (tj. Intersticiální tekutině) ve srovnání s krevní plazmou. Na tomto základě byly detekovány rozdíly související s onemocněním, například zvýšené koncentrace kortizolu u pacienta trpícím syndromem Cushingu. Přesto je však pro stanovení této metody pro diagnostické a léčebné účely zapotřebí rozšířená zkoumání dynamiky aldosteronu a kortizolu v intersticiální tekutině v různých klinických scénářích nadbytku hormonů a ověření proti měření v séru.

Tento projekt má zastřešující cíle (1) stanovení dynamického intersticiálního aldosteronu a monitorování kortizolu jako spolehlivý diagnostický nástroj pro nadbytek nebo nedostatek kortizolu a aldosteronu a (2) vyvinout nositelné molekulární snímací zařízení, aby je přesně detekovalo. V pracovním balíčku 1 (Charakterizace intersticiálních koncentrací kortizolu a aldosteronu): Diagnostická užitečnost měření kortizolu a aldosteronu v intersticiální tekutině bude hodnocena srovnávací kvantifikací s koncentrací séra pomocí LC-MS/MS. Proto bude intersticiální tekutina a krev odebrána u zdravých jedinců a pacientů ráno (když kortizol a aldosteron dosáhne nejvyšších úrovní) a během dynamických testů pro zkoumání onemocnění nadledvin, jako je acth (contropin) stimulační test (který hodnotí a -adosteron a reaguje na hlasitost a na infúzi a je to, že je předsunující a -adosteron a předsunul předsudek). Protože kontinuální intersticiální tekutina není dosud možná, komerčně dostupná dutá mikroneedle zařízení budou použita pro extrakci s jedním časovým bodem.

Hlavní hypotéza 1: Koncentrace kortizolu a aldosteronu v intersticiální tekutině odrážejí dostatečně dobře krevní sérové ​​koncentrace, aby spolehlivě naznačovaly normální sekreci steroidů a nástup poruchy kortizolu a aldosteronu.

V tomto prvním kroku budou vyšetřovatelé provést párové srovnání koncentrací kortizolu a aldosteronu v intersticiální tekutině s měřením séra. Tato studie bude předložena odpovědným etickým výborům USP. Všichni účastníci podepsají písemný informovaný souhlas. Vyšetřovatelé vyhodnotí 150 jedinců, včetně zdravých kontrol a pacientů s nadledvinovou hyper- a hypofunkcí uvedenou k hodnocení na ambulantní klinice nadledvin, divize endokrinologie, USP. Klinické a hormonální hodnocení zapsaných pacientů s poruchami nadledvin bude následovat standardní pokyny endokrinní a evropské společnosti endokrinologie. Všechny zdravé kontroly (bez předchozí diagnózy onemocnění nadledvin) budou mít schůzku na vyplnění dotazníku anamnézy a shromažďování krevních testů.

Jednotlivci (muži a ženy) starší 18 let budou mít nárok na zařazení. Budou přijímáni pacienti s širokým spektrem onemocnění nadledvin: nedostatek kortizolu a aldosteronu (primární nadledvinová nedostatečnost), přebytek kortizolu (Cushing Syndrome) a přebytek aldosteronu (primární aldosteronismus). Jediný časopis každého účastníka bude vyhodnocen ráno po nočním půstu a bez ranního léku. Toto základní hodnocení umožní vzorkovat materiál s normální, nízkou (nadledvinovou nedostatečnost) a vysokou (Cushingův syndrom a primární aldosteronismus) obsah nadledvin. Kromě toho bude proveden stimulační test ACTH (intravenózní 250 µg kosmentropinu) u zdravých kontrol a pacienti s zkoumáním nadledvin a primárního aldosteronismu pro korelaci intersticiálního aldosteronu a hladiny kortizolu s hladinou alosteronu po 1H po 1H acth stimulus. U pacientů s zkoumáním pro primární aldosteronismus bude proveden test infuze fyziologického roztoku (intravenózní 2 litru 0,9% fyziologického roztoku po 4 hodiny). Tyto dynamické testy budou prováděny v dynamické zkušební místnosti na ambulantní klinice, která se počítá s týmem endokrinologa, zdravotní sestry a techniků vyškolených pro endokrinní dynamické hodnocení. Kritéria pro vyloučení budou následující: použití perorálních antikoncepčních léků obsahujících estrogen během posledních 6 týdnů; těhotenství nebo laktace; Použití perorálních, inhalačních, parenterálních nebo topických glukokortikoidů za posledních 30 dní. Sběr bazálních vzorků a dynamické testy budou prováděny v půstu mezi 8:00 do 10:00.

V pracovním balíčku 2 (vytvořte duté mikroneedles pro kontinuální intersticiální extrakci tekutin), vyšetřovatelé prokáží přímý tisk mikroneedů na bázi polymeru s optimalizovanou mechanickou a tekutinovou dynamickou vlastností na mikrofluidní čipy pro kontinuální intersticiální extrakci tekutin: bude vyvinuta nositelná náplast pro kontinuální interstitiální extrakci. Bude se skládat z dutých mikroneedů přímo 3D potištěných na mikrofluidní čipy. Jehly budou založeny na biokompatibilním polymeru, aby se minimalizovalo podráždění kůže během prodloužené aplikace, zatímco mikrofluidní čipy budou vyrobeny škálovatelným mikromachiningem. Hloubka a stabilita penetrace jehly bude testována na analogy lidské kůže, zatímco dynamické vlastnosti tekutin a rychlost extrakce jsou hodnoceny umělou intersticiální tekutinou.

Hlavní hypotéza 2: Intersticiální tekutina lze přistupovat neinvazivně a nepřetržitě po delších obdobích s dutými mikroneedy založenými na biokompatibilních materiálech.

In work package 3 (Establish and utilize steroid biosensor based on aptamer-functionalized nanoparticles Biosensors for real-time and continuous quantification of cortisol and aldosterone in interstitial fluid will be developed) the investigators will investigate aptamer-functionalized nanoparticles decorated with plasmonic clusters to bind steroids followed by their release through light stimulation to yield selective and rapidly reversible sensing Pro monitorování kontinuálního biomarkeru: Receptor bude založen na aptamerech, které jsou imobilizovány na nanočásticích, aby se detekovaly vazbu analytů a kvantifikovaly koncentrace elektrochemicky. Nanočástice budou naplněny také plazmonickými klastry (např. Au nebo Ag), aby sloužily jako tepelný zdroj při aktivaci světlem pro spuštění uvolňování analytů. Nanočástice nakládané klastrové budou navrženy v kontrolovaném složení a velikosti pomocí technologie plamene aerosolu a uloženy přímo na mikrofluidní platformy jako porézní filmy.

Hlavní hypotéza 3: Aptamery umožní selektivní vazbu kortizolu a aldosteronu. Imobilizací těchto aptamerů na nanočásticích jsou vazebné události rozpoznány během elektrochemického snímání. Obnovení senzoru bude povoleno využitím termoplasmonických účinků, když je vystaveno světlu, spuštěno uvolňování analytu lokálním vytápěním. Porézní filmová morfologie snímacího filmu umožňuje rychlý hromadný přenos analytu.

Na základě požadavků na výkon, které USP v rámci WP1 identifikované USP, bude biosenzor vyvinut v ETH Curychu, aby provedl v reálném čase a kontinuální kvantifikaci kortizolu a aldosteronu, aby poskytoval podélné profily.

V pracovním balíčku 4 (Klinická validace nositelného aldosteronu a senzoru kortizolu u nadledvin) nositelný biosenzor vyvinutý pod WP2 a WP3 bude hodnocen jako diagnostický nástroj pro onemocnění nadledvin. Písemný informovaný souhlas bude podepsán všemi účastníky po schválení etických komisí USP. Všichni účastníci budou hodnoceni na ambulantní klinice adrenální jednotky, divize endokrinologie, USP. Dynamické testy (ACTH stimulace a testy infuze fyziologického roztoku) budou provedeny v dynamické zkušební místnosti na ambulantní klinice, která se počítá s týmem endokrinologa, zdravotní sestry a techniků vyškolených pro endokrinní dynamické vyhodnocení. Klinické a hormonální hodnocení zapsaných pacientů s poruchami nadledvin bude následovat standardní pokyny endokrinní a evropské společnosti endokrinologie. Všechny zdravé kontroly (bez předchozí diagnózy onemocnění nadledvin) budou mít schůzku na vyplnění dotazníku anamnézy a shromažďování krevních testů. Účastníci budou požádáni, aby si udrželi pravidelné spaní, zdrželi se alkoholu a aby se vyhnuli jakékoli namáhavé fyzické aktivitě před a během použití biosenzoru. Kromě toho budou účastníci požádáni, aby dokončili deník aktivity, včetně záznamů o typu potravin a načasování, načasování spánku a jakékoli neočekávané události během doby nošení biosenzoru. 96 prototypů budou přeneseny z ETH na USP a testovány během 48 hodin v následujících podskupinách za určených podmínek:

Kontroly: 32 zdravých dobrovolníků bude testováno během stimulačního testu ACTH (intravenózní 250 µg contropin) ráno ráno druhého dne kontinuálního měření kortizolu a aldosteronu.

Poruchy kortizolu: 32 pacientů s nadledvinovou nedostatečností nebo syndromem Cushingu bude testováno během stimulačního testu ACTH druhý den nepřetržitého měření steroidů.

Primární aldosteronismus: 32 pacientů ve zkoumání primárního aldosteronismu bude neustále monitorováno. Test infuze fyziologického roztoku (intravenózní 2 1 0,9% fyziologický roztok po 4 hodiny) bude proveden ve druhém dni nepřetržitého měření aldosteronu a kortizolu.

Jako další krok validace biosenzoru budou vzorky krve odebrány ráno (8:00 do 10:00) a během dynamických testů (ACTH stimulace a testy infuze solného) pro měření kortizolu a aldosteronu LC-MS/MS. Bude analyzována korelace mezi koncentracemi kortizolu a aldosteronu v séru a aldosteronu a intersticiálními měřeními získanými s biosenzorem. V době užívání biosenzoru se pro každého pacienta vypočítá celková plocha pod křivkou (AUC), ranní vrchol a noční nadir kortizolu a aldosteronu intersticiální měření. Tato opatření budou porovnána mezi pacienty s onemocněním nadledvin a zdravými kontrolami pro stanovení diagnostických aplikací dynamiky intersticiálního kortizolu a aldosteronu.

K těmto čtyřem výzvám se přiblíží interdisciplinární tým na USP (klinický) a ETH (inženýrství) prostřednictvím čtyř pracovních balíčků (WP) se zaměřením na charakterizaci intersticiální tekutiny (WP1), mikroneedle sampleru (WP2), biosensing (WP3) a klinické validace (WP4) (WP4) (WP4) (WP4) (WP4) (WP4).