Indbyrdes relationer mellem glukose, hjerne, tarmmikrobiota og mikroRNA'er (IRONmiRNA). (IRONmiRNA)

Emner og metoder:

A. Tværsnitsundersøgelse:

Patienter med fedme, der tidligere var planlagt til Service of Endocrinology, Diabetes and Nutrition (UDEN) på Hospitalet "Dr. Josep Trueta" fra Girona (Spanien) vil blive rekrutteret og studeret. Forsøgspersoner uden fedme vil også blive rekrutteret gennem en offentlig annoncering.

En glykæmisensor vil blive indsat i ti dage, samt en aktivitets- og søvnsporingsenhed (Fitbit) til at registrere fysisk aktivitet i denne periode. Interstitielle subkutane glukosekoncentrationer vil blive overvåget ambulant i en periode på 10 på hinanden følgende dage ved hjælp af en glukosesensor valideret af Food and Drug Administration (Dexcom G6 ®). Sensoren vil blive indsat på dag 0, og den vil trække sig tilbage på dag 10 midt på formiddagen.

Glukoseregistreringer vil fortrinsvis blive evalueret på dag 2 til 9 for at undgå bias forårsaget af indsættelse og fjernelse af sensoren, hvilket forhindrer en tilstrækkelig stabilisering af overvågningssystemet. Det karakteristiske glykæmiske mønster for hver patient vil blive beregnet i gennemsnit ud fra profilerne opnået på dag 2 til 9.

I slutningen af ​​ugen vil der blive foretaget magnetisk resonansbilleddannelse for at evaluere jernindholdet i hjernen og parametre for "Diffusion Tensor Imaging" i forskellige hjerneterritorier.

Kognitive tests vil blive udført, og afføring og urin vil blive indsamlet til undersøgelse af mikrobiotaen. Derudover vil der blive indsamlet blodprøver til ekstraktion og oprensning af cirkulerende RNA og derefter retrotranskription af cirkulerende miRNA'er og præamplifikation.

Projektet vil blive udført i forsøgspersoner med fedme (20 mænd, 20 præmenopausale kvinder og 20 kvinder postmenopausale, kropsmasseindeks (BMI) > = 30 kg/m2) og forsøgspersoner uden fedme, ens i alder, køn og overgangsalderen ( 20 mænd, 20 præmenopausale kvinder og 20 postmenopausale kvinder, BMI <30 kg/m2).

B. Longitudinelle undersøgelse:

Efter et års opfølgning, hvor personer med fedme vil gennemgå konventionel behandling (hypokalorisk diæt og råd om fysisk aktivitet) eller fedmekirurgi for vægttab, vil der blive gennemført et andet besøg.

Til sammenligning vil den samme protokol for tværsnitsundersøgelsen blive udført igen. Se oplysningerne ovenfor.

DATAINDSAMLING AF EMNER I Tværsnits- og længdestudier:

1. Underordnede data: Alder, køn og fødselsdato.

2. Kliniske variabler:

   • Vægt
   • højde,
   • BMI
   • talje- og hofteomkreds
   • talje-til-hofte-forhold
   • blodtryk (systolisk og diastolisk)
   • fedtmasse og fedtfri masse (bioelektrisk impedans og DEXA)
   • rygestatus
   • alkoholindtag
   • register over sædvanlige lægemidler
   • personlig historie med blodtransfusion og/eller donation
   • en optegnelse over familiehistorie med fedme, kardiovaskulære hændelser og diabetes
   • psykiatrisk og spiseforstyrrelseshistorie.

3. Laboratorievariabler: 15 cc blod vil blive ekstraheret fra fastende forsøgspersoner for at bestemme følgende variabler ved brug af de sædvanlige rutineteknikker i det kliniske laboratorium:

   • hæmogram
   • glukose
   • bilirubin
   • aspartat aminotransferase (AST/GOT)
   • alanin aminotransferase (ALT/GPT)
   • gamma-glutamyl transpeptidase (GGT)
   • urinstof
   • kreatinin
   • urinsyre
   • samlede proteiner,
   • albumin
   • total kolesterol | HDL-kolesterol | LDL kolesterol
   • triglycerider,
   • glykeret hæmoglobin (HbA1c)
   • ferritin | opløselig transferrinreceptor
   • ultrafølsomt C-reaktivt protein
   • erytrocytsedimentationshastighed
   • lipopolysaccharid bindende protein
   • fri thyroxin (fri T4) | thyreoideastimulerende hormon (TSH) | baseline cortisol-plasma insulin
   • betændelsesmarkører | interleukin 6 (IL-6). Yderligere 15 cc blod (plasma-EDTA) vil blive ekstraheret til yderligere analyser.

4. Indsamling af afføringsprøver: En afføringsprøve vil blive givet fra hver patient. Prøven skal indsamles hjemme eller på hospitalet, sendes til laboratoriet inden for 4 timer efter indsamlingen, fragmenteres og opbevares ved -80ºC.

   Analyse af tarmmikrobiota i afføring:

   * Bestemmelse af bakteriel DNA og mRNA og undersøgelse af det LBP bindende protein i blodet til påvisning af bakteriel translokation. LBP bindende protein i blodet til påvisning af bakteriel translokation. Hiseq og Nextseq teknologi (qPCR og proteinanalyse (WB, ELISA), OMICS (RNAseq, 16S, Metabolomics, Metagenomics).

5. Urinprøvesamling: Nødvendig for at bestemme ændringer i de metaboliske veje, der er involveret i tryptofanmetabolisme, og for at bestemme tarmmikrobiotaens rolle i disse metaboliske ændringer.
6. Magnetisk resonansbilleddannelse: Alle MR-undersøgelser vil blive udført på en 1,5-T scanner (Ingenia ®; Philips Medical Systems). Først vil en fluid-attenuated inversion recovery (FLAIR)-sekvens blive brugt til at udelukke forsøgspersoner med allerede eksisterende hjernelæsioner. Hjernens jernbelastning vil blive vurderet ved hjælp af R2* værdier. T2*-relaksationsdata vil blive erhvervet med en multi-ekko gradient-ekkosekvens med 10 lige store ekkoer (første ekko=4,6ms; mellem ekkoafstand=4,6ms; gentagelsestid = 1300ms). T2* vil blive beregnet ved at tilpasse de enkelte eksponentielle termer til signalhenfaldskurverne for de respektive multi-ekko data. R2* værdier vil blive beregnet som R2*=1/T2* og udtrykt som Hz. Derudover vil R2*-værdier blive konverteret til μmol Fe/g-enheder som tidligere valideret på fantomtests. Hjernejernsbilleder fra kontrolpersoner vil blive normaliseret til et standardrum ved hjælp af et skabelonbillede til dette formål (EPI MNI-skabelon). Efterfølgende vil alle normaliserede billeder blive gennemsnittet til bestemmelse af normalt jernindhold. Normale værdier (middelværdi og SD) vil også blive beregnet for anatomiske områder af interesse ved hjælp af forskellige atlasmasker, der adresserer mulige forskelle mellem køn og alder. Hjernejern-sammenligningen mellem kontrol- og overvægtige forsøgspersoner vil blive udført ved hjælp af voxel-baseret analyse. Billeder med overvægtige motiver vil blive normaliseret til et standardrum. Det normaliserede billede vil blive sammenlignet med normalpopulationen ved hjælp af t-testanalyse med alder og køn som co-variable. Som et resultat vil et parametrisk kort vise individuelle forskelle i jernaflejringen. Baseret på tidligere observationsstudier, der viser øget jernbelastning i hjernen i nogle specifikke regioner og evidensen, der tyder på hippocampus og hypothalamus ændringer i forbindelse med fedme og insulinresistens, vil de statistiske analyser og billedanalyser være fokuseret på jernforskelle ved caudatus, lentikulær, thalamus, hypothalamus , hippocampus og amygdala.
7. Neuropsykologisk undersøgelse: Forskellige kognitionsdomæner vil blive udforsket: hukommelse (Test aprendizaje verbal-TAVEC, Rey-Osterrieth Complex Figure) opmærksomhed og eksekutiv funktion (WAIS-IV, Trail making test (Del A og B), Stroop test), social kognition (POFA og BFRT), sprog (dyr). Desuden depression (PHQ9), angst (State-Trait Anxiety Inventory (STAI)), impulsivitet (Impulsive Behavior Scale (UPPS-P)), følsomhed over for straf og belønning (Sensitivity to Punishment and Sensitivity to Reward (SRSPQ)), mad afhængighed (Yale Food Addiction Scale (YFAS II)), subjektivt velvære, positiv og negativ affekt (Positive and Negative Affect Schedule (PANAS)) vil blive udforsket gennem psykologiske tests.

8. Profil af cirkulerende miRNA'er

   • Cirkulerende RNA-ekstraktion og oprensning: Plasma vil blive opnået ved standard venepunktur og centrifugering ved hjælp af EDTA-coatede Vacutainer-rør (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Plasmaseparation vil blive udført ved dobbelt centrifugering ved hjælp af en laboratoriecentrifuge (Beckman J-6M Induction Drive Centrifuge, Beckman Instruments Inc.). RNA-ekstraktion vil blive udført fra et indledende volumen på 300 μL plasma ved hjælp af mirVana PARIS-isoleringssættet (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland).
   • Retrotranskription af cirkulerende miRNA'er og præamplifikation: Et fast volumen på 3 μL RNA-opløsning fra 40 ml eluatet af RNA-isolatet vil blive brugt som input til retrotranskription ved hjælp af TaqMan miRNA revers transkriptionskit (Life Technology, Darmstadt, Tyskland). Preamplifikation vil blive udført ved hjælp af TaqMan PreAmp Master Mix (Life Technology, Darmstadt, Tyskland).
   • Analyse af individuelle miRNA'er ved TaqMan-hydrolyseprober: Genekspression vil blive vurderet ved real-time PCR ved hjælp af LightCycler 480 real-time PCR-systemet (Roche Diagnostics, Barcelona, ​​Spanien), ved hjælp af den passende TaqMan-teknologi til kvantificering af relativ genekspression.

Oplysningerne vil forblive registreret i en notesbog og vil blive computeriseret i undersøgelsens database.

STATISKE METODER:

Prøvestørrelse: Der er ingen tidligere data, der viser forventede forskelle for prøvestørrelsesestimation vedrørende glukosevariabilitet, fysisk aktivitet, sammensætningen af ​​tarmmikrobiota og kognitiv funktion. I en tidligere undersøgelse blev der observeret forskelle i hjernens jernindhold hos 20 overvægtige mod 20 ikke-overvægtige forsøgspersoner. Den foreslåede stikprøvestørrelse er således mindst 20 individer pr. gruppe med afbalanceret alders- og kønsrepræsentation (præ- og postmenopausale kvinder).

Statistiske analyser: Først vil normalfordeling og varianshomogenitet blive testet. For at bestemme forskelle mellem undersøgelsesgrupper vil den blive brugt χ2 for kategoriske variable, uparret Students t-test i normal kvantitativ og Mann-Whitney U-test for ikke-normale kvantitative variable. Ikke-parametrisk Spearman-analyse vil blive brugt til at bestemme sammenhængen mellem kvantitative variable. De samme tests vil også blive brugt til at undersøge forskelle før og efter opfølgning. De signifikante sammenhænge, ​​uanset om de er positive eller negative, vil blive udforsket mere dybtgående (simpel og multivariat lineær regressionsanalyser).

Mikrobiotasammensætningen vil blive analyseret og sammenlignet under anvendelse af R "ALDEx2". Bakteriearter og funktioner forbundet med hjernejern og cirkulerende mikroRNA'er vil blive identificeret ved hjælp af robuste lineære regressionsmodeller som implementeret i R-pakken (Limma R). Desuden vil p-værdier blive justeret for flere sammenligninger ved hjælp af R-pakken "SGoF". Mål for glykæmisk variabilitet vil blive beregnet ved hjælp af Matlab-software (R2018a).