Interrelazioni tra glucosio, cervello, microbiota intestinale e microRNA (IRONmiRNA). (IRONmiRNA)

Materie e metodi:

A. Studio trasversale:

I pazienti con obesità precedentemente inseriti nel Servizio di Endocrinologia, Diabete e Nutrizione (UDEN) dell'Ospedale "Dr. Josep Trueta" di Girona (Spagna) sarà reclutato e studiato. Anche i soggetti senza obesità verranno reclutati tramite annuncio pubblico.

Verrà inserito un sensore glicemico per dieci giorni, nonché un dispositivo di monitoraggio dell'attività e del sonno (Fitbit) per registrare l'attività fisica durante questo periodo di tempo. Le concentrazioni di glucosio sottocutaneo interstiziale saranno monitorate in regime ambulatoriale per un periodo di 10 giorni consecutivi utilizzando un sensore di glucosio convalidato dalla Food and Drug Administration (Dexcom G6 ®). Il sensore verrà inserito il giorno 0 e verrà ritirato il giorno 10 a metà mattinata.

Le registrazioni della glicemia saranno valutate preferibilmente nei giorni dal 2 al 9 per evitare la distorsione causata dall'inserimento e dalla rimozione del sensore, che impedisce una sufficiente stabilizzazione del sistema di monitoraggio. Il profilo glicemico caratteristico di ciascun paziente sarà calcolato in media dai profili ottenuti nei giorni dal 2 al 9.

Alla fine della settimana verrà effettuata una risonanza magnetica per valutare il contenuto di ferro nel cervello e parametri di "Diffusion Tensor Imaging" in diversi territori cerebrali.

Verranno effettuati test cognitivi e verranno raccolte feci e urine per lo studio del microbiota. Inoltre, verranno raccolti campioni di sangue per l'estrazione e la purificazione dell'RNA circolante e quindi la retrotrascrizione dei miRNA circolanti e la preamplificazione.

Il progetto sarà condotto in soggetti con obesità (20 uomini, 20 donne in premenopausa e 20 donne in postmenopausa, indice di massa corporea (BMI) > = 30 kg/m2) e soggetti senza obesità, simili per età, sesso e stato menopausale ( 20 uomini, 20 donne in premenopausa e 20 donne in postmenopausa, BMI <30 kg/m2).

B. Studio longitudinale:

Dopo un anno di follow-up, in cui i soggetti con obesità verranno sottoposti a trattamento convenzionale (dieta ipocalorica e consigli di attività fisica) o intervento di chirurgia bariatrica per la perdita di peso, verrà effettuata una seconda visita.

Per confronto, verrà ripetuto lo stesso protocollo dello studio trasversale. Vedi le informazioni sopra.

RACCOLTA DATI DI SOGGETTI DI STUDI TRASVERSALI E LONGITUDINALI:

1. Dati sussidiari: età, sesso e data di nascita.

2. Variabili cliniche:

   • Peso
   • altezza,
   • indice di massa corporea
   • perimetri della vita e dei fianchi
   • rapporto vita-fianchi
   • pressione arteriosa (sistolica e diastolica)
   • massa grassa e massa magra (impedenza bioelettrica e DEXA)
   • stato di fumatore
   • assunzione di alcol
   • registro dei medicinali abituali
   • storia personale di trasfusioni e/o donazioni di sangue
   • una storia familiare di obesità, eventi cardiovascolari e diabete
   • storia di disturbi psichiatrici e alimentari.

3. Variabili di laboratorio: 15cc di sangue verranno estratti da soggetti a digiuno per determinare le seguenti variabili utilizzando le consuete tecniche di routine del laboratorio clinico:

   • emogramma
   • glucosio
   • bilirubina
   • aspartato aminotransferasi (AST/GOT)
   • alanina aminotransferasi (ALT/GPT)
   • gamma-glutamil transpeptidasi (GGT)
   • urea
   • creatinina
   • acido urico
   • proteine ​​totali,
   • albumina
   • colesterolo totale | Colesterolo HDL | colesterolo LDL
   • trigliceridi,
   • emoglobina glicata (HbA1c)
   • ferritina | recettore solubile della transferrina
   • proteina C reattiva ultrasensibile
   • velocità di sedimentazione eritrocitaria
   • proteina legante il lipopolisaccaride
   • tiroxina libera (T4 libera) | ormone stimolante la tiroide (TSH) | cortisolo-insulina plasmatica basale
   • marcatori di infiammazione | interleuchina 6 (IL-6). Verranno estratti ulteriori 15 cc di sangue (plasma-EDTA) per ulteriori analisi.

4. Raccolta campioni di feci: verrà fornito un campione di feci per ciascun paziente. Il campione deve essere raccolto a casa o in ospedale, inviato al laboratorio entro 4 ore dalla raccolta, frammentato e conservato a -80ºC.

   Analisi del microbiota intestinale nelle feci:

   *Determinazione del DNA e dell'mRNA batterico e studio della proteina legante LBP nel sangue per l'individuazione della traslocazione batterica. Proteina legante LBP nel sangue per il rilevamento della traslocazione batterica. Tecnologia Hiseq e Nextseq (qPCR e analisi delle proteine ​​(WB, ELISA), OMICS (RNAseq, 16S, Metabolomics, Metagenomics).

5. Raccolta dei campioni di urina: necessaria per determinare le alterazioni nelle vie metaboliche coinvolte nel metabolismo del triptofano e per determinare il ruolo del microbiota intestinale in questi cambiamenti metabolici.
6. Imaging a risonanza magnetica: tutti gli esami MRI verranno eseguiti su uno scanner da 1,5 T (Ingenia ®; Philips Medical Systems). Innanzitutto, verrà utilizzata una sequenza FLAIR (fluid-attenuated inversion recovery) per escludere soggetti con lesioni cerebrali preesistenti. Il carico di ferro nel cervello sarà valutato mediante i valori R2*. I dati di rilassamento T2* verranno acquisiti con una sequenza gradient-echo multi-eco con 10 echi equidistanti (primo eco=4,6 ms; spaziatura tra gli echi=4,6 ms; tempo di ripetizione=1300ms). T2* sarà calcolato adattando i singoli termini esponenziali alle curve di decadimento del segnale dei rispettivi dati multi-eco. I valori R2* saranno calcolati come R2*=1/T2* ed espressi in Hz. Inoltre, i valori R2* verranno convertiti in unità μmol Fe/g come precedentemente convalidato su test fantasma. Le immagini del ferro cerebrale dei soggetti di controllo verranno normalizzate in uno spazio standard utilizzando un'immagine modello per questo scopo (modello EPI MNI). Successivamente, su tutte le immagini normalizzate verrà calcolata la media per la determinazione del normale contenuto di ferro. I valori normali (media e DS) saranno calcolati anche per le regioni anatomiche di interesse utilizzando diverse maschere atlante, tenendo conto delle possibili differenze tra sesso ed età. Il confronto del ferro cerebrale tra soggetti di controllo e soggetti obesi verrà eseguito utilizzando l'analisi basata su voxel. Le immagini dei soggetti obesi verranno normalizzate in uno spazio standard. L'immagine normalizzata verrà confrontata con la popolazione normale utilizzando l'analisi t-test con età e sesso come covariabili. Di conseguenza, una mappa parametrica mostrerà le differenze individuali nella deposizione di ferro. Sulla base di precedenti studi osservazionali che mostrano un aumento del carico di ferro nel cervello in alcune regioni specifiche e sull'evidenza che suggerisce cambiamenti nell'ippocampo e nell'ipotalamo in associazione con l'obesità e la resistenza all'insulina, le analisi statistiche e di immagine si concentreranno sulle differenze di ferro a livello del caudato, del lenticolare, del talamo e dell'ipotalamo. , ippocampo e amigdala.
7. Esame neuropsicologico: verranno esplorati diversi domini cognitivi: memoria (Test aprendizaje verbal-TAVEC, Rey-Osterrieth Complex Figure), attenzione e funzioni esecutive (WAIS-IV, Trail making test (Part A y B), Stroop test), sociali cognizione (POFA e BFRT), linguaggio (animali). Inoltre, depressione (PHQ9), ansia (State-Trait Anxiety Inventory (STAI)), impulsività (Impulsive Behavior Scale (UPPS-P)), sensibilità alla punizione e alla ricompensa (Sensibilità alla punizione e sensibilità alla ricompensa (SRSPQ)), cibo la dipendenza (Yale Food Addiction Scale (YFAS II)), il benessere soggettivo, gli affetti positivi e negativi (Positive and Negative Affect Schedule (PANAS)) saranno esplorati attraverso test psicologici.

8. Profilo dei miRNA circolanti

   • Estrazione e purificazione dell'RNA circolante: il plasma sarà ottenuto mediante puntura venosa standard e centrifugazione utilizzando provette Vacutainer rivestite con EDTA (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). La separazione del plasma verrà eseguita mediante doppia centrifugazione utilizzando una centrifuga da laboratorio (Beckman J-6M Induction Drive Centrifuge, Beckman Instruments Inc). L'estrazione dell'RNA verrà eseguita da un volume iniziale di 300 μL di plasma utilizzando il kit di isolamento mirVana PARIS (Applied Biosystems, Darmstadt, Germania).
   • Retrotrascrizione dei miRNA circolanti e preamplificazione: un volume fisso di 3 μL di soluzione di RNA dall'eluato da 40 mL dell'isolato di RNA verrà utilizzato come input per la retrotrascrizione utilizzando il kit di trascrizione inversa TaqMan miRNA (Life Technology, Darmstadt, Germania). La preamplificazione verrà effettuata utilizzando il TaqMan PreAmp Master Mix (Life Technology, Darmstadt, Germania).
   • Analisi dei singoli miRNA mediante sonde di idrolisi TaqMan: l'espressione genica sarà valutata mediante PCR in tempo reale utilizzando il sistema PCR in tempo reale LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Barcellona, ​​Spagna), utilizzando l'appropriata tecnologia TaqMan per la quantificazione dell'espressione genica relativa.

Le informazioni rimarranno registrate in un quaderno e saranno informatizzate nel database dello studio.

METODI STATICI:

Dimensione del campione: non ci sono dati precedenti che mostrino differenze attese per la stima della dimensione del campione per quanto riguarda la variabilità del glucosio, l’attività fisica, la composizione del microbiota intestinale e la funzione cognitiva. In uno studio precedente, sono state osservate differenze nel contenuto di ferro nel cervello in 20 soggetti obesi rispetto a 20 soggetti non obesi. Pertanto, la dimensione del campione proposta è di almeno 20 individui per gruppo, con una rappresentanza equilibrata di età e sesso (donne in pre- e postmenopausa).

Analisi statistiche: in primo luogo verranno testate la distribuzione normale e l'omogeneità delle varianze. Per determinare le differenze tra i gruppi di studio, verrà utilizzato il χ2 per le variabili categoriali, il test t di Student non appaiato per le variabili quantitative normali e il test U di Mann-Whitney per le variabili quantitative non normali. L'analisi di Spearman non parametrica verrà utilizzata per determinare la correlazione tra variabili quantitative. Gli stessi test verranno utilizzati anche per studiare le differenze prima e dopo il follow-up. Le associazioni significative, siano esse positive o negative, verranno esplorate più approfonditamente (analisi di regressione lineare semplice e multivariata).

La composizione del microbiota verrà analizzata e confrontata utilizzando R "ALDEx2". Le specie batteriche e le funzioni associate al ferro cerebrale e ai microRNA circolanti saranno identificate utilizzando robusti modelli di regressione lineare implementati nel pacchetto R (Limma R). Inoltre, i valori p saranno aggiustati per confronti multipli utilizzando il pacchetto R "SGoF". Le misure della variabilità glicemica saranno calcolate utilizzando il software Matlab (R2018a).